Métabolit imunomodulator mangrupikeun fitur konci tina lingkungan mikro tumor (TME), tapi kalayan sababaraha pengecualian, idéntitasna masih teu dipikanyaho. Di dieu, urang nganalisis tumor sareng sél T tina tumor sareng ascites pasien anu ngagaduhan karsinoma serous tingkat luhur (HGSC) pikeun ngungkabkeun métabolom tina kompartemen TME anu béda ieu. Ascites sareng sél tumor gaduh bédana métabolit anu lega. Dibandingkeun sareng ascites, sél T anu nyusup tumor sacara signifikan diperkaya ku 1-methylnicotinamide (MNA). Sanaos tingkat MNA dina sél T ningkat, éksprési nicotinamide N-methyltransferase (énzim anu ngatalisis transfer gugus metil tina S-adenosilmethionine ka nikotinamide) diwatesan ku fibroblas sareng sél tumor. Sacara fungsional, MNA ngainduksi sél T pikeun ngaluarkeun sitokin faktor nekrosis tumor alpha anu ngamajukeun tumor. Ku alatan éta, MNA anu diturunkeun tina TME nyumbang kana régulasi imun sél T sareng ngagambarkeun target imunoterapi poténsial pikeun pengobatan kanker manusa.
Métabolit anu diturunkeun tina tumor tiasa gaduh pangaruh inhibisi anu ageung kana imunitas anti-tumor, sareng beuki seueur bukti anu nunjukkeun yén éta ogé tiasa janten kakuatan pendorong konci pikeun kamajuan panyakit (1). Salian ti pangaruh Warburg, panilitian anyar parantos dimimitian pikeun ngajelaskeun kaayaan métabolik sél tumor sareng hubunganana sareng kaayaan imun lingkungan mikro tumor (TME). Panilitian ngeunaan modél beurit sareng sél T manusa parantos nunjukkeun yén métabolisme glutamin (2), métabolisme oksidatif (3) sareng métabolisme glukosa (4) tiasa bertindak sacara mandiri dina rupa-rupa subkelompok sél imun. Sababaraha metabolit dina jalur ieu ngahambat fungsi anti-tumor sél T. Parantos kabuktian yén blokade koénzim tetrahydrobiopterin (BH4) tiasa ngaruksak proliferasi sél T, sareng paningkatan BH4 dina awak tiasa ningkatkeun réspon imun anti-tumor anu dimediasi ku CD4 sareng CD8. Salaku tambahan, pangaruh imunosupresif kynurenine tiasa disalametkeun ku administrasi BH4 (5). Dina glioblastoma mutan isositrat dehidrogenase (IDH), sékrési énantiometabolik (R)-2-hidroksiklutarat (R-2-HG) ngahalangan aktivasi, proliferasi, sareng aktivitas sitolisis sél T (6). Anyar-anyar ieu, parantos dipidangkeun yén metilglyoxal, produk sampingan tina glikolisis, dihasilkeun ku sél supresor asal myeloid, sareng transfer sél T tina metilglyoxal tiasa ngahalangan fungsi sél T éféktor. Dina pangobatan, nétralisasi metilglyoxal tiasa ngungkulan aktivitas sél supresor turunan myeloid (MDSC) sareng sacara sinergis ningkatkeun terapi blokade titik pamariksaan dina modél beurit (7). Panilitian ieu sacara koléktif nekenkeun peran konci metabolit turunan TME dina ngatur fungsi sareng aktivitas sél T.
Disfungsi sél T parantos dilaporkeun sacara lega dina kanker ovarium (8). Ieu sabagian kusabab ciri métabolik anu aya dina hipoksia sareng vaskularisasi tumor anu teu normal (9), anu ngahasilkeun konvérsi glukosa sareng triptofan janten produk sampingan sapertos asam laktat sareng kynurenine. Laktat ékstrasélulér anu kaleuleuwihi ngirangan produksi interferon-γ (IFN-γ) sareng ngadorong diferensiasi subgrup myelosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan sacara langsung ngahalangan proliferasi sél T sareng ngahalangan sinyal reséptor sél T (12-14). Sanaos aya observasi ieu, seueur padamelan anu aya hubunganana sareng métabolisme imun dilaksanakeun dina kultur sél T in vitro nganggo média anu dioptimalkeun, atanapi diwatesan ku modél beurit homolog in vivo, anu duanana henteu ngagambarkeun sacara lengkep hétérogénitas kanker manusa sareng lingkungan makro sareng mikro fisiologis.
Ciri umum kanker ovarium nyaéta panyebaran peritoneal sareng munculna asites. Akumulasi cairan sél dina asites aya hubunganana sareng panyakit lanjut sareng prognosis anu goréng (15). Numutkeun laporan, kompartemen unik ieu hipoksia, ngagaduhan tingkat faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) sareng indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) anu luhur, sareng disusupi ku sél pangatur T sareng sél inhibitor myeloid (15-18). Lingkungan métabolik asites tiasa béda ti tumor éta sorangan, janten program ulang sél T dina rohangan peritoneal teu jelas. Salaku tambahan, bédana konci sareng hétérogénitas antara asites sareng metabolit anu aya dina lingkungan tumor tiasa ngahalangan infiltrasi sél imun sareng fungsina dina tumor, sareng panilitian salajengna diperyogikeun.
Pikeun ngarengsekeun masalah ieu, kami ngarancang metode pamisahan sél sénsitip sareng kromatografi cair spéktrométri massa tandem (LC-MS/MS) pikeun nalungtik rupa-rupa jinis sél (kalebet sél CD4+ sareng CD8+) ogé di jero sareng di antara tumor. Métabolitna ngalingkup sél dina asites sareng lingkungan tumor anu sami sareng pasien. Kami nganggo metode ieu babarengan sareng sitometri aliran diménsi luhur sareng sekuensing RNA sél tunggal (scRNA-seq) pikeun nyayogikeun potret anu jelas ngeunaan status métabolik populasi konci ieu. Metode ieu ngungkabkeun paningkatan anu signifikan dina tingkat 1-metilnikotinamida (MNA) dina sél T tumor, sareng ékspérimén in vitro nunjukkeun yén pangaruh imunomodulator MNA kana fungsi sél T sateuacanna teu dipikanyaho. Sacara umum, metode ieu ngungkabkeun interaksi métabolik silih antara tumor sareng sél imun, sareng nyayogikeun wawasan anu unik kana metabolit pangaturan imun, anu tiasa mangpaat pikeun pengobatan kasempetan perawatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sél T.
Kami nganggo sitometri aliran diménsi luhur pikeun sacara simultan ngitung serapan glukosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukosa (2-NBDG) sareng aktivitas mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) mangrupikeun pananda has anu ngabédakeun sél imun sareng populasi sél tumor (Tabel S2 sareng Gambar S1A). Analisis ieu nunjukkeun yén dibandingkeun sareng sél T, asites sareng sél tumor gaduh tingkat serapan glukosa anu langkung luhur, tapi gaduh bédana anu langkung alit dina aktivitas mitokondria. Serapan glukosa rata-rata sél tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] nyaéta tilu dugi ka opat kali tibatan sél T, sareng serapan glukosa rata-rata sél T CD4 + nyaéta 1,2 kali tibatan sél T CD8 +, anu nunjukkeun limfosit infiltrasi tumor (TIL) gaduh sarat métabolik anu béda bahkan dina TME anu sami (Gambar 1A). Sabalikna, aktivitas mitokondria dina sél tumor sami sareng sél CD4 + T, sareng aktivitas mitokondria tina dua jinis sél langkung luhur tibatan sél CD8 + T (Gambar 1B). Sacara umum, hasil ieu ngungkabkeun tingkat métabolik. Aktivitas métabolik sél tumor langkung luhur tibatan sél CD4 + T, sareng aktivitas métabolik sél CD4 + T langkung luhur tibatan sél CD8 + T. Sanaos aya pangaruh ieu dina sadaya jinis sél, teu aya bédana anu konsisten dina status métabolik sél CD4 + sareng CD8 + T atanapi proporsi relatifna dina asites dibandingkeun sareng tumor (Gambar 1C). Sabalikna, dina fraksi sél CD45, proporsi sél EpCAM + dina tumor ningkat dibandingkeun sareng asites (Gambar 1D). Kami ogé niténan bédana métabolik anu jelas antara komponén sél EpCAM + sareng EpCAM-. Sél EpCAM + (tumor) ngagaduhan serapan glukosa sareng aktivitas mitokondria anu langkung luhur tibatan sél EpCAM-, anu jauh langkung luhur tibatan aktivitas métabolik fibroblas dina sél tumor dina TME (Gambar 1, E sareng F).
(A sareng B) Inténsitas fluoresensi median (MFI) tina serapan glukosa (2-NBDG) (A) sareng aktivitas mitokondria sél T CD4 + (MitoTracker beureum poék) (B) Grafik répréséntatif (kénca) sareng data tabulasi (Katuhu), sél T CD8 + sareng sél tumor EpCAM + CD45 tina asites sareng tumor. (C) Babandingan sél CD4 + sareng CD8 + (tina sél T CD3 +) dina asites sareng tumor. (D) Proporsi sél tumor EpCAM + dina asites sareng tumor (CD45−). (E sareng F) Serapan glukosa EpCAM + CD45-tumor sareng matriks EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) sareng aktivitas mitokondria (MitoTracker beureum poék) (F) grafik répréséntatif (kénca) sareng data tabulasi (Katuhu) Asites sareng sél tumor. (G) Grafik répréséntatif tina éksprési CD25, CD137 sareng PD1 ku sitometri aliran. (H sareng I) Éksprési CD25, CD137 sareng PD1 dina sél CD4 + T (H) sareng sél CD8 + T (I). (J sareng K) Fenotipe mémori sentral (Tcm), éféktor (Teff) sareng mémori éféktor (Tem) anu naif dumasar kana éksprési CCR7 sareng CD45RO. Gambar répréséntatif (kénca) sareng data tabular (katuhu) sél CD4 + T (J) sareng sél CD8 + T (K) dina asites sareng tumor. Nilai P ditangtukeun ku uji-t anu dipasangkeun (*P<0,05, **P<0,01 sareng ***P<0,001). Garis éta ngagambarkeun pasién anu cocog (n = 6). FMO, fluoresensi minus hiji; MFI, inténsitas fluoresensi median.
Analisis salajengna ngungkabkeun béda anu signifikan antara status fenotipik sél T anu parantos direngsekeun kalayan saé. Mémori anu diaktipkeun (Gambar 1, G dugi ka I) sareng éféktor (Gambar 1, J sareng K) dina tumor langkung sering tibatan asites (proporsi sél CD3 + T). Nya kitu, nganalisis fenotipe ku éksprési spidol aktivasi (CD25 sareng CD137) sareng spidol deplesi [protéin maot sél anu diprogram 1 (PD1)] nunjukkeun yén sanaos karakteristik métabolik populasi ieu béda (Gambar S1, B dugi ka E), Tapi teu aya béda métabolik anu signifikan anu sacara konsisten dititénan antara himpunan bagian naif, éféktor atanapi mémori (Gambar S1, F dugi ka I). ​​Hasil ieu dikonfirmasi ku ngagunakeun metode pembelajaran mesin pikeun sacara otomatis nangtukeun fenotipe sél (21), anu salajengna ngungkabkeun ayana sajumlah ageung sél sumsum tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) dina asites pasien (Gambar S2A). Di antara sadaya jinis sél anu diidentipikasi, populasi sél myeloid ieu nunjukkeun serapan glukosa sareng aktivitas mitokondria pangluhurna (Gambar S2, B dugi ka G). Hasil ieu nyorot béda métabolik anu kuat antara sababaraha jinis sél anu aya dina asites sareng tumor dina pasien HGSC.
Tangtangan utama dina ngartos karakteristik métabonomi TIL nyaéta kabutuhan pikeun ngasingkeun sampel sél T anu cukup murni, kualitas, sareng kuantitasna tina tumor. Panilitian anyar nunjukkeun yén metode sorting sareng pengayaan manik dumasar kana flow cytometry tiasa nyababkeun parobahan dina profil metabolit sélular (22-24). Pikeun ngungkulan masalah ieu, kami ngaoptimalkeun metode pengayaan manik pikeun ngasingkeun sareng ngasingkeun TIL tina kanker ovarium manusa anu dioperasi sateuacan dianalisis ku LC-MS/MS (tingali Bahan sareng Métode; Gambar 2A). Pikeun meunteun dampak sakabéh protokol ieu kana parobahan metabolit, kami ngabandingkeun profil metabolit sél T anu diaktipkeun ku donor séhat saatos léngkah pamisahan manik di luhur sareng sél anu henteu dipisahkeun manik tapi tetep dina és. Analisis kontrol kualitas ieu mendakan yén aya korélasi anu luhur antara dua kaayaan ieu (r = 0,77), sareng repeatability téknis tina kelompok 86 metabolit gaduh repeatability anu luhur (Gambar 2B). Ku kituna, metode ieu tiasa ngalaksanakeun analisis metabolit anu akurat dina sél anu ngalaman pangayaan tipe sél, sahingga nyayogikeun platform résolusi tinggi anu munggaran pikeun ngaidentipikasi metabolit spésifik dina HGSC, sahingga ngamungkinkeun jalma pikeun kéngingkeun pamahaman anu langkung jero ngeunaan spésifisitas sél Program métabolisme séksual.
(A) Diagram skematis pangayaan manik magnét. Sateuacan dianalisis ku LC-MS/MS, sél-sél bakal ngalaman tilu puteran pangayaan manik magnét sacara berturut-turut atanapi tetep dina és. (B) Pangaruh jinis pangayaan kana kaayaan metabolit. Rata-rata tilu pangukuran pikeun unggal jinis pangayaan ± SE. Garis kulawu ngagambarkeun hubungan 1:1. Korélasi intra-kelas (ICC) tina pangukuran anu diulang-ulang dipidangkeun dina labél sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematis alur kerja analisis metabolit pasien. Asites atanapi tumor dikumpulkeun ti pasien sareng dikriopreservasi. Sabagian leutik tina unggal sampel dianalisis ku sitometri aliran, sedengkeun sampel sésana ngalaman tilu puteran pangayaan pikeun sél CD4+, CD8+ sareng CD45-. Fraksi sél ieu dianalisis nganggo LC-MS/MS. (D) Peta panas kaayaan metabolit standar. Dendrogram ngagambarkeun klaster Ward tina jarak Euclidean antara sampel. (E) Analisis komponén utama (PCA) tina peta metabolit sampel, nunjukkeun tilu réplika unggal sampel, sampel ti pasien anu sami dihubungkeun ku garis. (F) PCA tina profil metabolit sampel anu dikondisikeun kana pasien (nyaéta, nganggo redundansi parsial); jinis sampel diwatesan ku lambung konveks. PC1, komponén utama 1; PC2, komponén utama 2.
Salajengna, urang nerapkeun metode pangayaan ieu pikeun nganalisis 99 metabolit dina fraksi sél CD4 +, CD8 + sareng CD45 dina asites primér sareng tumor genep pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A sareng Tabel S3 sareng S4). Populasi anu dipikaresep nyumbang 2% dugi ka 70% tina sampel ageung asli sél hirup, sareng proporsi sél bénten-bénten pisan antara pasien. Saatos misahkeun manik-manik, fraksi anu dipikaresep anu diperkaya (CD4 +, CD8 + atanapi CD45-) nyumbang langkung ti 85% tina sadaya sél hirup dina sampel rata-rata. Metode pangayaan ieu ngamungkinkeun urang pikeun nganalisis populasi sél tina métabolisme jaringan tumor manusa, anu teu mungkin dilakukeun tina sampel ageung. Nganggo protokol ieu, urang nangtukeun yén l-kynurenine sareng adénosin, dua metabolit imunosupresif anu dicirikeun kalayan saé ieu ningkat dina sél T tumor atanapi sél tumor (Gambar S3, B sareng C). Ku alatan éta, hasil ieu nunjukkeun kasatiaan sareng kamampuan téknologi pamisahan sél sareng spéktrométri massa urang pikeun mendakan metabolit anu penting sacara biologis dina jaringan pasien.
Analisis kami ogé ngungkabkeun pamisahan métabolik anu kuat tina jinis sél dina sareng antara pasien (Gambar 2D sareng Gambar S4A). Khususna, dibandingkeun sareng pasien sanés, pasien 70 nunjukkeun ciri métabolik anu béda (Gambar 2E sareng Gambar S4B), nunjukkeun yén tiasa aya hétérogénitas métabolik anu substansial antara pasien. Perlu dicatet yén dibandingkeun sareng pasien sanés (1,2 dugi ka 2 liter; Tabel S1), jumlah total asites anu dikumpulkeun dina pasien 70 (80 ml) langkung alit. Kontrol hétérogénitas antar-pasien salami analisis komponén utama (contona, nganggo analisis redundansi parsial) nunjukkeun parobahan anu konsisten antara jinis sél, sareng jinis sél sareng/atanapi lingkungan mikro sacara jelas dikumpulkeun numutkeun profil métabolit (Gambar 2F). Analisis metabolit tunggal nekenkeun épék ieu sareng ngungkabkeun béda anu signifikan antara jinis sél sareng lingkungan mikro. Perlu dicatet yén bédana anu paling ekstrim anu dititénan nyaéta MNA, anu biasana diperkaya dina sél CD45- sareng dina sél CD4+ sareng CD8+ anu nyusup kana tumor (Gambar 3A). Pikeun sél CD4+, pangaruh ieu paling atra, sareng MNA dina sél CD8+ ogé sigana kapangaruhan pisan ku lingkungan. Nanging, ieu teu penting, sabab ngan tilu tina genep pasién anu tiasa dievaluasi pikeun skor tumor CD8+. Salian ti MNA, dina rupa-rupa jinis sél dina asites sareng tumor, metabolit sanés anu kirang dicirikeun dina TIL ogé beunghar sacara béda (Gambar S3 sareng S4). Ku alatan éta, data ieu ngungkabkeun sakumpulan metabolit imunomodulator anu ngajangjikeun pikeun panalungtikan salajengna.
(A) Eusi MNA anu dinormalisasi dina sél CD4+, CD8+ sareng CD45- tina asites sareng tumor. Plot kotak nunjukkeun median (garis), rentang interkuartil (engsel pigura) sareng rentang data, dugi ka 1,5 kali rentang interkuartil (kumis pigura). Sakumaha anu dijelaskeun dina Bahan sareng Métode Pasien, anggo nilai limma pasien pikeun nangtukeun nilai P (*P<0,05 sareng **P<0,01). (B) Diagram skematis métabolisme MNA (60). Métabolit: S-adenosil-1-métionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein; NA, nikotinamida; MNA, 1-métilnikotinamida; 2-PY, 1-métil-2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-métil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Énzim (héjo): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenilate transferase; Pnp1, purin nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE tina scRNA-seq tina ascites (abu-abu) sareng tumor (beureum; n = 3 pasien). (D) Éksprési NNMT dina populasi sél anu béda-béda anu diidéntifikasi nganggo scRNA-seq. (E) Éksprési NNMT sareng AOX1 dina SK-OV-3, ginjal émbrionik manusa (HEK) 293T, sél T sareng sél T anu dirawat MNA. Éksprési anu dilipet dipidangkeun relatif ka SK-OV-3. Pola éksprési sareng SEM dipidangkeun (n = 6 donor séhat). Nilai Ct anu langkung ageung tibatan 35 dianggap teu tiasa dideteksi (UD). (F) Éksprési SLC22A1 sareng SLC22A2 dina SK-OV-3, HEK293T, sél T sareng sél T anu dirawat ku 8mM MNA. Éksprési anu dilipet dipidangkeun relatif ka SK-OV-3. Pola éksprési sareng SEM dipidangkeun (n = 6 donor séhat). Nilai Ct anu langkung ageung tibatan 35 dianggap teu tiasa dideteksi (UD). (G) Eusi MNA sél dina sél T donor séhat anu diaktipkeun saatos 72 jam inkubasi sareng MNA. Pola éksprési sareng SEM dipidangkeun (n = 4 donor séhat).
MNA dihasilkeun ku cara mindahkeun gugus metil tina S-adenosil-1-metionin (SAM) ka nikotinamida (NA) ku nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT diekspresikan sacara kaleuleuwihi dina rupa-rupa kanker manusa sareng aya hubunganana sareng proliferasi, invasi sareng metastasis (25-27). Pikeun langkung ngartos sumber MNA dina sél T dina TME, kami nganggo scRNA-seq pikeun ngajelaskeun éksprési NNMT dina sadaya jinis sél dina asites sareng tumor tilu pasien HGSC (Tabel S5). Analisis sakitar 6.500 sél nunjukkeun yén dina asites sareng lingkungan tumor, éksprési NNMT diwatesan kana populasi sél fibroblas sareng tumor anu disangka (Gambar 3, C sareng D). Perlu dicatet yén teu aya éksprési NNMT anu jelas dina populasi naon waé anu ngébréhkeun PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D sareng Gambar S5A), anu nunjukkeun yén MNA anu dideteksi dina spéktrum metabolit parantos diwanohkeun kana sél T. Éksprési aldehida oksidase 1 (AOX1) ngarobah MNA jadi 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atawa 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Gambar 3B) ogé diwatesan pikeun populasi fibroblas anu ngébréhkeun COL1A1 (Gambar S5A), anu babarengan nunjukkeun yén sél T kakurangan kamampuan métabolisme MNA konvensional. Pola éksprési gén anu aya hubunganana sareng MNA ieu diverifikasi nganggo sét data sél mandiri kadua tina ascites ti pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Salian ti éta, analisis réaksi ranté polimérase kuantitatif (qPCR) sél T donor séhat anu diubaran ku MNA nunjukkeun yén dibandingkeun sareng sél tumor ovarium kontrol SK-OV-3, NNMT atanapi AOX1 ampir teu diébréhkeun (Gambar 3E). Hasil anu teu disangka-sangka ieu nunjukkeun yén MNA tiasa disekresikeun tina fibroblas atanapi tumor kana sél T anu caket dina TME.
Sanaos calon kalebet kulawarga transporter kation organik 1 dugi ka 3 (OCT1, OCT2 sareng OCT3) anu dikodekeun ku kulawarga operator leyur 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 sareng SLC22A3), transporter poténsial MNA masih teu acan ditetepkeun (28). QPCR mRNA tina sél T donor anu séhat nunjukkeun tingkat éksprési SLC22A1 anu handap tapi tingkat SLC22A2 anu teu tiasa dideteksi, anu mastikeun yén éta parantos dilaporkeun sateuacanna dina literatur (Gambar 3F) (29). Sabalikna, garis sél tumor ovarium SK-OV-3 ngébréhkeun tingkat anu luhur tina duanana transporter (Gambar 3F).
Pikeun nguji kamungkinan sél T anu gaduh kamampuan pikeun nyerep MNA asing, sél T donor anu séhat dikultur salami 72 jam kalayan ayana konsentrasi MNA anu béda. Upami teu aya MNA éksogén, eusi sélular MNA teu tiasa dideteksi (Gambar 3G). Nanging, sél T anu diaktipkeun anu dirawat ku MNA éksogén nunjukkeun paningkatan eusi MNA anu gumantung kana dosis dina sél, dugi ka 6 mM MNA (Gambar 3G). Hasil ieu nunjukkeun yén sanaos tingkat éksprési transporter anu handap sareng kurangna énzim utama anu tanggung jawab pikeun métabolisme MNA intraseluler, TIL masih tiasa nyerep MNA.
Spéktrum metabolit dina sél T pasien sareng ékspérimén panyerepan MNA in vitro ningkatkeun kamungkinan yén fibroblas anu aya hubunganana sareng kanker (CAF) ngaluarkeun MNA sareng sél tumor tiasa ngatur fenotipe sareng fungsi TIL. Pikeun nangtukeun pangaruh MNA kana sél T, sél T donor anu séhat diaktipkeun in vitro kalayan ayana atanapi henteuna MNA, sareng proliferasi sareng produksi sitokinna dievaluasi. Saatos 7 dinten nambihan MNA dina dosis pangluhurna, jumlah populasi anu dua kali lipat dikirangan sacara sedeng, sedengkeun vigor dijaga dina sadaya dosis (Gambar 4A). Salaku tambahan, pangobatan MNA éksogén nyababkeun paningkatan dina proporsi sél T CD4 + sareng CD8 + anu ngébréhkeun faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sabalikna, produksi intraseluler IFN-γ dikirangan sacara signifikan dina sél T CD4 +, tapi henteu dina sél T CD8 +, sareng teu aya parobihan anu signifikan dina interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C sareng D). Ku kituna, uji imunosorben nu numbu ka énzim (ELISA) tina supernatan tina kultur sél T anu dirawat ku MNA ieu nunjukkeun paningkatan anu signifikan dina TNFα, panurunan dina IFN-γ, sareng teu aya parobahan dina IL-2 (Gambar 4, E dugi ka G). . Panurunan IFN-γ nunjukkeun yén MNA tiasa maénkeun peran dina ngahambat aktivitas anti-tumor sél T. Pikeun simulasi pangaruh MNA kana sitotoksisitas anu dimediasi sél T, sél reséptor antigen chimeric T (FRα-CAR-T) anu nargétkeun reséptor folat α sareng CAR-T (GFP) anu diatur ku sél protéin fluoresensi héjo (GFP) -CAR-T) dihasilkeun ku sél mononuklear getih periferal donor anu séhat (PBMC). Sél CAR-T dikultur salami 24 jam dina ayana MNA, teras dikultur babarengan sareng sél tumor ovarium SK-OV-3 manusa anu ngébréhkeun reséptor folat α dina babandingan éféktor ka target 10:1. Perawatan MNA ngahasilkeun panurunan anu signifikan dina aktivitas pembunuhan sél FRα-CAR-T, anu sami sareng sél FRα-CAR-T anu dirawat ku adénosin (Gambar 4H).
(A) Jumlah sél anu hirup sareng panggandaan populasi (PD) total langsung tina kultur dina dinten ka-7. Grafik batang ngagambarkeun rata-rata + SEM tina genep donor anu séhat. Ngagambarkeun data tina sahenteuna n = 3 ékspérimén mandiri. (B dugi ka D) CD3/CD28 sareng IL-2 dianggo pikeun ngaktipkeun sél T dina konsentrasi MNA masing-masing salami 7 dinten. Sateuacan analisis, sél dirangsang ku PMA/ionomisin sareng GolgiStop salami 4 jam. Éksprési TNFα (B) dina sél T. Conto gambar (kénca) sareng data tabular (katuhu) tina éksprési TNFα dina sél hirup. Éksprési IFN-γ (C) sareng IL-2 (D) dina sél T. Éksprési sitokin diukur ku sitometri aliran. Grafik batang ngagambarkeun rata-rata (n = 6 donor séhat) + SEM. Anggo analisis varian hiji arah sareng ukuran anu diulang (*P<0,05 sareng **P<0,01) pikeun nangtukeun nilai P. Ngagambarkeun data tina sahenteuna n = 3 ékspérimén mandiri. (E ka G) CD3/CD28 sareng IL-2 dianggo pikeun ngaktipkeun sél T dina konsentrasi MNA masing-masing salami 7 dinten. Médium dikumpulkeun sateuacan sareng saatos 4 jam stimulasi PMA/ionomisin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) sareng IL-2 (G) diukur ku ELISA. Grafik batang ngagambarkeun rata-rata (n = 5 donor séhat) + SEM. Nilai P ditangtukeun nganggo analisis varian hiji arah sareng pangukuran anu diulang (*P<0,05). Garis putus-putus nunjukkeun wates deteksi deteksi. (H) Uji lisis sél. Sél FRα-CAR-T atanapi GFP-CAR-T disaluyukeun nganggo adénosin (250μM) atanapi MNA (10 mM) salami 24 jam, atanapi henteu diubaran (Ctrl). Persentase pembunuhan sél SK-OV-3 diukur. Nilai P ditangtukeun ku uji t Welch (*P<0,5 sareng **P<0,01).
Pikeun meunangkeun pamahaman mékanistik ngeunaan régulasi éksprési TNFα anu gumantung kana MNA, parobahan dina mRNA TNFα tina sél T anu diubaran ku MNA dievaluasi (Gambar 5A). Sél T donor séhat anu diubaran ku MNA nunjukkeun paningkatan dua kali lipat dina tingkat transkripsi TNFα, nunjukkeun yén MNA gumantung kana régulasi transkripsi TNFα. Pikeun nalungtik mékanisme pangaturan anu mungkin ieu, dua faktor transkripsi anu dipikanyaho anu ngatur TNFα, nyaéta faktor nuklir sél T anu diaktipkeun (NFAT) sareng protéin spésifik 1 (Sp1), dievaluasi salaku réspon kana pangiket MNA kana promotor TNFα proksimal (30). Promotor TNFα ngandung 6 situs pangiket NFAT anu diidentifikasi sareng 2 situs pangiket Sp1, tumpang tindih dina hiji situs [-55 pasangan basa (bp) tina 5'cap] (30). Imunoprésipitasi kromatin (ChIP) nunjukkeun yén nalika diubaran ku MNA, pangiket Sp1 kana promotor TNFα ningkat tilu kali lipat. Gabungan NFAT ogé ningkat sareng ngadeukeutan pentingna (Gambar 5B). Data ieu nunjukkeun yén MNA ngatur éksprési TNFα ngaliwatan transkripsi Sp1, sareng dina tingkat anu langkung alit nyaéta éksprési NFAT.
(A) Dibandingkeun sareng sél T anu dibudidayakeun tanpa MNA, parobahan lipatan éksprési TNFα dina sél T anu dirawat ku MNA. Pola éksprési nganggo SEM dipidangkeun (n = 5 donor séhat). Ngawakilan data tina sahenteuna n = 3 ékspérimén mandiri. (B) Promotor TNFα sél T anu dirawat ku atanapi tanpa 8 mM MNA saatos NFAT sareng Sp1 digabungkeun sareng (Ctrl) sareng stimulasi PMA/ionomisin salami 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) sareng H3 dianggo salaku kontrol négatip sareng positip pikeun imunoprésipitasi. Kuantifikasi ChIP nunjukkeun yén beungkeutan Sp1 sareng NFAT kana promotor TNFα dina sél anu dirawat MNA ningkat sababaraha kali dibandingkeun sareng kontrol. Ngawakilan data tina sahenteuna n = 3 ékspérimén mandiri. Nilai P ditangtukeun ku sababaraha tés-t (*** P <0,01). (C) Dibandingkeun sareng asites HGSC, sél T (non-sitotoksik) nunjukkeun paningkatan éksprési TNF dina tumor. Warna-warna ngawakilan pasien anu béda. Sél-sél anu dipidangkeun parantos dicicip sacara acak dugi ka 300 sareng di-jitter pikeun ngawatesan overdrawing (** Padj = 0,0076). (D) Modél MNA anu diusulkeun pikeun kanker ovarium. MNA dihasilkeun dina sél tumor sareng fibroblas dina TME sareng dicandak ku sél T. MNA ningkatkeun beungkeutan Sp1 kana promotor TNFα, anu ngarah kana paningkatan transkripsi TNFα sareng produksi sitokin TNFα. MNA ogé nyababkeun panurunan IFN-γ. Inhibisi fungsi sél T nyababkeun turunna kamampuan maéhan sareng ngagancangkeun kamekaran tumor.
Numutkeun laporan, TNFα ngagaduhan pangaruh anti-tumor sareng anti-tumor anu gumantung ka hareup sareng tukang, tapi éta ngagaduhan peran anu terkenal dina ngamajukeun kamekaran sareng metastasis kanker ovarium (31-33). Numutkeun laporan, konsentrasi TNFα dina asites sareng jaringan tumor dina pasien kanker ovarium langkung luhur tibatan dina jaringan jinak (34-36). Dina hal mékanisme, TNFα tiasa ngatur aktivasi, fungsi sareng proliferasi sél getih bodas, sareng ngarobih fenotipe sél kanker (37, 38). Saluyu sareng panemuan ieu, analisis éksprési gén diferensial nunjukkeun yén TNF sacara signifikan ningkat dina sél T dina jaringan tumor dibandingkeun sareng asites (Gambar 5C). Kanaékan éksprési TNF ngan ukur katingali dina populasi sél T kalayan fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Singkatna, data ieu ngadukung pandangan yén MNA ngagaduhan pangaruh imunosupresif sareng promosi tumor ganda dina HGSC.
Pelabelan fluoresensi dumasar kana sitometri aliran parantos janten metode utama pikeun nalungtik métabolisme TIL. Panilitian ieu nunjukkeun yén dibandingkeun sareng limfosit getih periferal atanapi sél T tina organ limfoid sekundér, TIL murine sareng manusa gaduh kacenderungan anu langkung luhur pikeun nyerep glukosa (4, 39) sareng leungitna fungsi mitokondria laun-laun (19, 40). Sanaos urang parantos niténan hasil anu sami dina panilitian ieu, pamekaran konci nyaéta ngabandingkeun métabolisme sél tumor sareng TIL tina jaringan tumor anu sami anu dipotong. Saluyu sareng sababaraha laporan sateuacana ieu, sél tumor (CD45-EpCAM +) tina asites sareng tumor gaduh panyerepan glukosa anu langkung luhur tibatan sél T CD8 + sareng CD4 +, anu ngadukung yén panyerepan glukosa anu luhur tina sél tumor tiasa dibandingkeun sareng sél T. Konsép kompetisi sél T. TME. Nanging, aktivitas mitokondria sél tumor langkung luhur tibatan sél T CD8 +, tapi aktivitas mitokondria sami sareng sél T CD4 +. Hasil ieu nguatkeun téma anu muncul yén métabolisme oksidatif penting pikeun sél tumor (41, 42). Aranjeunna ogé nunjukkeun yén sél CD8 + T tiasa langkung rentan ka disfungsi oksidatif tibatan sél CD4 + T, atanapi sél CD4 + T tiasa nganggo sumber karbon salian ti glukosa pikeun ngajaga aktivitas mitokondria (43, 44). Perlu dicatet yén urang henteu niténan bédana dina serapan glukosa atanapi aktivitas mitokondria antara efektor CD4 + T, mémori efektor T sareng sél mémori pusat T dina asites. Nya kitu, kaayaan diferensiasi sél CD8 + T dina tumor teu aya hubunganana sareng parobahan serapan glukosa, anu nyorot bédana anu signifikan antara sél T anu dibudidayakeun in vitro sareng TIL manusa in vivo (22). Observasi ieu ogé dikonfirmasi ku panggunaan alokasi populasi sél otomatis anu teu bias, anu salajengna ngungkabkeun yén sél CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + kalayan serapan glukosa sareng aktivitas mitokondria anu langkung luhur tibatan sél tumor nyebar tapi gaduh populasi sél aktif métabolik. Populasi ieu tiasa ngawakilan subpopulasi putatif sél supresor myeloid atanapi sél dendritik plasmacytoid anu diidentifikasi dina analisis scRNA-seq. Sanaos duanana ieu parantos dilaporkeun dina tumor ovarium manusa [45], aranjeunna masih peryogi panilitian salajengna nyaéta pikeun ngajelaskeun subpopulasi myeloid ieu.
Sanaos metode anu didasarkeun kana sitometri aliran tiasa ngajelaskeun bédana umum dina métabolisme glukosa sareng oksidatif antara jinis sél, metabolit anu pasti anu dihasilkeun ku glukosa atanapi sumber karbon sanés pikeun métabolisme mitokondria dina TME tacan ditangtukeun. Nangtukeun ayana atanapi henteuna metabolit kana subkumpulan TIL anu dipasihkeun meryogikeun purifikasi populasi sél tina jaringan anu dipotong. Ku alatan éta, metode pangayaan sél kami digabungkeun sareng spéktrometri massa tiasa masihan wawasan ngeunaan metabolit anu diperkaya sacara béda dina sél T sareng populasi sél tumor dina sampel pasien anu cocog. Sanaos metode ieu gaduh kaunggulan tibatan panyortiran sél anu diaktipkeun ku fluoresensi, perpustakaan metabolit tertentu tiasa kapangaruhan kusabab stabilitas bawaan sareng / atanapi laju pergantian anu gancang (22). Nanging, metode kami tiasa ngaidentipikasi dua metabolit imunosupresif anu dikenal, adénosin sareng kynurenin, sabab béda-béda pisan antara jinis sampel.
Analisis métabonomi kami ngeunaan tumor sareng subtipe TIL nyayogikeun langkung seueur wawasan ngeunaan peran metabolit dina TME ovarium. Mimitina, nganggo sitometri aliran, kami nangtukeun yén teu aya bédana dina aktivitas mitokondria antara tumor sareng sél CD4 + T. Nanging, analisis LC-MS / MS ngungkabkeun parobihan anu signifikan dina seueurna metabolit di antara populasi ieu, nunjukkeun yén kacindekan ngeunaan métabolisme TIL sareng aktivitas métabolikna sacara umum meryogikeun interpretasi anu ati-ati. Kadua, MNA nyaéta metabolit anu gaduh bédana panggedéna antara sél CD45 sareng sél T dina asites, sanés tumor. Ku alatan éta, kompartementalisasi sareng lokasi tumor tiasa gaduh pangaruh anu béda dina métabolisme TIL, anu nyorot kamungkinan hétérogénitas dina lingkungan mikro anu dipasihkeun. Katilu, éksprési énzim anu ngahasilkeun MNA NNMT utamina diwatesan ku CAF, nyaéta sél tumor dina tingkat anu langkung alit, tapi tingkat MNA anu tiasa dideteksi dititénan dina sél T anu diturunkeun tina tumor. Overekspresi NNMT dina CAF ovarium gaduh pangaruh promosi kanker anu dipikanyaho, sabagian kusabab promosi métabolisme CAF, invasi tumor sareng metastasis (27). Sanaos tingkat TIL sacara umum sedeng, éksprési NNMT dina CAF raket patalina sareng subtipe mesenchymal Cancer Genome Atlas (TCGA), anu aya hubunganana sareng prognosis anu goréng (27, 46, 47). Pamungkas, éksprési énzim AOX1 anu tanggung jawab kana degradasi MNA ogé diwatesan kana populasi CAF, anu nunjukkeun yén sél T kakurangan kamampuan pikeun métabolisme MNA. Hasil ieu ngadukung ideu yén sanaos diperyogikeun panilitian salajengna pikeun mastikeun panemuan ieu, tingkat MNA anu luhur dina sél T tiasa nunjukkeun ayana lingkungan mikro CAF imunosupresif.
Kusabab tingkat éksprési transporter MNA anu handap sareng tingkat protéin konci anu teu tiasa dideteksi anu kalibet dina métabolisme MNA, ayana MNA dina sél T teu disangka-sangka. Boh NNMT atanapi AOX1 teu tiasa dideteksi ku analisis scRNA-seq sareng qPCR anu ditargetkeun tina dua kohort mandiri. Hasil ieu nunjukkeun yén MNA henteu disintésis ku sél T, tapi diserep tina TME di sakurilingna. Ékspérimén in vitro nunjukkeun yén sél T condong ngumpulkeun MNA éksogén.
Panilitian in vitro kami nunjukkeun yén MNA éksogén ngainduksi éksprési TNFα dina sél T sareng ningkatkeun beungkeutan Sp1 kana promotor TNFα. Sanaos TNFα gaduh fungsi anti-tumor sareng anti-tumor, dina kanker ovarium, TNFα tiasa ngamajukeun kamekaran kanker ovarium (31-33). Nétralisasi TNFα dina kultur sél tumor ovarium atanapi ngaleungitkeun sinyal TNFα dina modél beurit tiasa ningkatkeun produksi sitokin radang anu dimediasi TNFα sareng ngahambat kamekaran tumor (32, 35). Ku alatan éta, dina hal ieu, MNA anu diturunkeun tina TME tiasa bertindak salaku metabolit pro-radang ngalangkungan mékanisme anu gumantung kana TNFα ngalangkungan loop autokrin, sahingga ngamajukeun kajadian sareng panyebaran kanker ovarium (31). Dumasar kana kamungkinan ieu, blokade TNFα nuju ditalungtik salaku agén terapi poténsial pikeun kanker ovarium (37, 48, 49). Salaku tambahan, MNA ngarusak sitotoksisitas sél CAR-T kana sél tumor ovarium, nyayogikeun bukti salajengna pikeun suprési imun anu dimediasi MNA. Sacara koléktif, hasil ieu nunjukkeun modél dimana tumor sareng sél CAF ngaluarkeun MNA kana TME ékstrasélulér. Ngaliwatan (i) stimulasi kamekaran kanker ovarium anu diinduksi TNF sareng (ii) inhibisi aktivitas sitotoksik sél T anu diinduksi MNA, ieu tiasa gaduh pangaruh tumor ganda (Gambar 5D).
Dina kacindekanana, ku cara nerapkeun kombinasi pangayaan sél gancang, sekuensing sél tunggal, sareng profil métabolik, panilitian ieu ngungkabkeun bédana imunometabolomik anu ageung antara tumor sareng sél ascites dina pasien HGSC. Analisis komprehensif ieu nunjukkeun yén aya bédana dina serapan glukosa sareng aktivitas mitokondria antara sél T, sareng ngaidentipikasi MNA salaku metabolit pangaturan imun otonom non-sél. Data ieu gaduh dampak kana kumaha TME mangaruhan métabolisme sél T dina kanker manusa. Sanaos kompetisi langsung pikeun nutrisi antara sél T sareng sél kanker parantos dilaporkeun, metabolit ogé tiasa bertindak salaku régulator teu langsung pikeun ngamajukeun kamajuan tumor sareng kamungkinan ngirangan réspon imun éndogén. Pedaran salajengna ngeunaan peran fungsional metabolit pangaturan ieu tiasa muka strategi alternatif pikeun ningkatkeun réspon imun anti-tumor.
Spésimén pasien sareng data klinis diala ngalangkungan gudang jaringan tumor kanker BC anu disertipikasi ku Jaringan Repositori Jaringan Kanada. Numutkeun protokol anu disatujuan ku Komite Étika Panalungtikan Kanker BC sareng Universitas British Columbia (H07-00463), sadaya spésimén pasien sareng data klinis kéngingkeun idin tinulis anu diinformasikeun atanapi sacara resmi ngabatalkeun idinna. Sampel disimpen dina BioBank anu disertipikasi (BRC-00290). Karakteristik pasien anu lengkep dipidangkeun dina Tabel S1 sareng S5. Pikeun kriopreservasi, piso bedah dianggo pikeun ngauraikeun sampel tumor pasien sacara mékanis teras ngadorongna ngalangkungan filter 100 mikron pikeun kéngingkeun suspénsi sél tunggal. Asites pasien disentrifugasi dina 1500 rpm salami 10 menit dina suhu 4°C pikeun ngabentuk pélét sél sareng miceun supernatan. Sél-sél anu diala tina tumor sareng asites dikriopreservasi dina 50% sérum AB manusa anu diinaktivasi panas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) sareng 10% dimetil sulfoksida. Suspénsi sél tunggal anu diawetkeun ieu dicairkeun sareng dianggo pikeun metabolomik sareng nangtukeun metabolit anu dijelaskeun di handap.
Médium lengkepna diwangun ku 0,22 μm anu disaring 50:50 ditambah RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) ditambah ku 10% sérum AB manusa anu diinaktivasi panas (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x larutan Penisilin Streptomisin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) sareng 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) ditambah ku 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) sareng 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Buffer pewarnaan flow cytometer diwangun ku 0,22 μm saringan fosfat buffered saline (PBS; Invitrogen) ditambah ku 3% sérum manusa AB anu diinaktivasi panas (Sigma). Buffer pangayaan sél diwangun ku PBS anu disaring 0,22μm sareng ditambahan ku sérum AB manusa anu diinaktivasi panas 0,5% (Sigma-Aldrich).
Dina média lengkep 37°C, sél-sél diwarnaan ku 10 nM MT DR sareng 100 μM 2-NBDG salami 30 menit. Salajengna, sél-sél diwarnaan ku pewarna viabilitas eF506 dina suhu 4°C salami 15 menit. Suspensikeun deui sél-sél dina FC Block (eBioscience) sareng Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), encerkeun dina buffer pewarnaan flow cytometer (numutkeun pitunjuk produsén), teras inkubasi salami 10 menit dina suhu kamar. Warnaan sél-sél ku sakumpulan antibodi (Tabel S2) dina buffer pewarnaan flow cytometry dina suhu 4°C salami 20 menit. Suspensikeun deui sél-sél dina buffer pewarnaan flow cytometry (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sateuacan dianalisis. Anggo SpectroFlo sareng FlowJo V10 pikeun nganalisis data jumlah sél, sareng anggo GraphPad Prism 8 pikeun nyiptakeun data. Inténsitas fluoresensi median (MFI) tina 2-NBDG sareng MT DR dinormalisasi sacara log, teras uji t anu dipasangkeun dianggo pikeun analisis statistik pikeun ngitung pasien anu cocog. Hapus sadaya populasi anu kirang ti 40 kajadian tina analisis; lebetkeun nilai MFI 1 pikeun nilai négatip sateuacan ngalakukeun analisis statistik sareng visualisasi data.
Pikeun ngalengkepan strategi gating manual tina panel prosés di luhur, kami nganggo anotasi lengkep ku tangkal larangan bentuk (FAUST) (21) pikeun sacara otomatis masihan sél kana populasi saatos ngaleungitkeun sél paéh dina FlowJo. Kami ngatur kaluaran sacara manual pikeun ngahijikeun populasi anu sigana salah alokasi (ngagabungkeun sél PD1+ sareng sél tumor PD1) sareng populasi anu ditahan. Unggal sampel ngandung rata-rata langkung ti 2% sél, pikeun total 11 populasi.
Sentrifugasi kapadetan gradien Ficoll dianggo pikeun misahkeun PBMC tina produk pamisahan leukosit (STEMCELL Technologies). Sél T CD8 + diisolasi tina PBMC nganggo CD8 MicroBeads (Miltenyi) sareng dilegaan dina média lengkep nganggo TransAct (Miltenyi) salami 2 minggu numutkeun pitunjuk produsén. Sél-sél éta diidinan nangtung salami 5 dinten dina média lengkep anu ngandung IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), teras distimulasi deui ku TransAct. Dina dinten ka-7, numutkeun pitunjuk produsén, MicroBeads CD45 manusa (Miltenyi) dianggo pikeun ngabeungharan sél dina tilu puteran berturut-turut. Sél-sél éta dialiquot pikeun analisis sitometri aliran (sakumaha anu dijelaskeun di luhur), sareng sajuta sél dialiquot tilu kali pikeun analisis LC-MS/MS. Sampel diolah ku LC-MS/MS sapertos anu dijelaskeun di handap. Kami ngira-ngira nilai metabolit anu leungit kalayan jumlah ion 1.000. Unggal sampel dinormalisasi ku jumlah ion total (TIC), dirobah sacara logaritmik sareng dinormalisasi sacara otomatis dina MetaboAnalystR sateuacan dianalisis.
Suspénsi sél tunggal unggal pasien dicairkeun sareng disaring ngalangkungan filter 40 μm kana média lengkep (sakumaha anu dijelaskeun di luhur). Numutkeun protokol produsén, tilu puteran seleksi positif sacara berturut-turut ku pamisahan manik magnét nganggo MicroBeads (Miltenyi) dianggo pikeun ngabeungharan sampel pikeun sél CD8+, CD4+ sareng CD45- (dina és). Singkatna, sél-sél disuspensikeun deui dina buffer pengayaan sél (sakumaha anu dijelaskeun di luhur) sareng diitung. Sél-sél diinkubasi sareng manik-manik CD8 manusa, manik-manik CD4 manusa atanapi manik-manik CD45 manusa (Miltenyi) dina suhu 4°C salami 15 menit, teras dikumbah ku buffer pengayaan sél. Sampel dialirkeun ngaliwatan kolom LS (Miltenyi), sareng fraksi positif sareng négatip dikumpulkeun. Pikeun ngirangan durasi sareng maksimalkeun léngkah pamulihan sél, fraksi CD8 teras dianggo pikeun puteran kadua pengayaan CD4+, sareng fraksi CD4 dianggo pikeun pengayaan CD45 salajengna. Simpen larutan dina és sapanjang prosés pamisahan.
Pikeun nyiapkeun sampel pikeun analisis metabolit, sél-sélna dikumbah sakali nganggo larutan uyah tiis, teras 1 ml metanol 80% ditambahkeun kana unggal sampel, teras divortex sareng dibekukeun dina nitrogén cair. Sampel-sampelna dikenakeun tilu siklus beku-cair sareng disentrifugasi dina 14.000 rpm salami 15 menit dina suhu 4°C. Supernatan anu ngandung metabolit diuapkeun dugi ka garing. Metabolit-metabolitna dilarutkeun deui dina 50 μl asam format 0,03%, divortex pikeun dicampur, teras disentrifugasi pikeun miceun runtah.
Ékstrak métabolit sakumaha anu dijelaskeun di luhur. Pindahkeun supernatan kana botol kromatografi cair kinerja tinggi pikeun panalungtikan métabolomika. Anggo protokol perlakuan acak pikeun ngubaran unggal sampel ku jumlah sél anu sami pikeun nyegah épék batch. Kami ngalaksanakeun penilaian kualitatif métabolit global anu sateuacanna diterbitkeun dina AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Analisis kromatografi sareng integrasi daérah puncak dilaksanakeun nganggo parangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Jumlah ion 1000 dianggo pikeun ngira-ngira nilai metabolit anu leungit, sareng TIC unggal sampel dianggo pikeun ngitung daérah puncak anu dinormalisasi tina unggal metabolit anu dideteksi pikeun ngabenerkeun parobihan anu diwanohkeun ku analisis instrumental tina pamrosésan sampel. Saatos TIC dinormalisasi, MetaboAnalystR(51) (parameter standar) dianggo pikeun konvérsi logaritmik sareng skala garis norma otomatis. Kami nganggo PCA kalayan pakét vegan R pikeun ngalaksanakeun analisis éksplorasi tina bédana métabolom antara jinis sampel, sareng nganggo analisis redundansi parsial pikeun nganalisis pasien. Anggo metode Ward pikeun ngawangun dendrogram peta panas pikeun ngelompokkeun jarak Euclidean antara sampel. Kami nganggo limma (52) dina kaayaan metabolit standar pikeun ngaidentipikasi metabolit anu béda-béda di sakumna jinis sél sareng lingkungan mikro. Pikeun nyederhanakeun katerangan, kami nganggo parameter rata-rata grup pikeun nangtukeun modél, sareng mertimbangkeun jinis sél dina lingkungan mikro salaku unggal grup (n = 6 grup); pikeun uji signifikansi, kami ngalakukeun tilu pangukuran anu diulang pikeun unggal metabolit Pikeun nyingkahan réplikasi palsu, pasien dilebetkeun salaku halangan dina desain limma. Pikeun mariksa bédana metabolit antara pasien anu béda, kami nyaluyukeun modél limma anu kalebet pasien ku cara anu tetep. Kami ngalaporkeun pentingna kontras anu parantos ditangtukeun antara jinis sél sareng lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Saatos pangayaan vigor nganggo Miltenyi Dead Cell Removal Kit (viabilitas >80%), sekuensing transkriptom sél tunggal dilakukeun dina total sampel asites beku hirup sareng tumor nganggo protokol éksprési 10x 5′gene. Lima kasus kalayan tumor sareng asites anu cocog dianalisis, sanaos viabilitas anu handap tina hiji sampel tumor nyegah kalebetna. Pikeun ngahontal sababaraha pilihan pasien, kami ngagabungkeun sampel unggal pasien dina jalur kontroler kromium 10x, sareng nganalisis asites sareng situs tumor sacara misah. Saatos sekuensing [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp paired end (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 sareng 41.378 bacaan per sél pikeun tumor sareng ascites masing-masing]], kami nganggo CellSNP sareng Vireo (53) (dumasar kana CellSNP salaku SNP manusa umum (VCF) anu disayogikeun ku GRCh38 ditugaskeun idéntitas donor. Kami nganggo SNPRelate pikeun nyimpulkeun idéntitas pangdeukeutna (IBS) tina status genotip pasien (IBS), ngaluarkeun sél anu teu ditugaskeun sareng sél anu diidentifikasi salaku dupleks sareng cocogkeun donor antara ascites sareng sampel tumor (54). Dumasar kana tugas ieu, kami nahan tilu kasus kalayan répréséntasi sél anu seueur dina tumor sareng ascites pikeun analisis hilir. Saatos ngalaksanakeun léngkah filtrasi massa dina bungkus BioConductor scater (55) sareng scran (56), ieu ngahasilkeun 6975 sél (masing-masing 2792 sareng 4183 sél tina tumor sareng ascites) pikeun analisis. Kami nganggo klaster Louvain igraph (57) tina jaringan tatangga pangdeukeutna anu dibagikeun (SNN) dumasar kana jarak Jaccard ka sél klaster ku éksprési. Klaster-kluster éta dibéré anotasi sacara manual kana jinis sél putatif dumasar kana éksprési gén pananda sareng divisualisasikeun nganggo t-SNE. Sél T sitotoksik dihartikeun ku éksprési CD8A sareng GZMA, teu kalebet subkluster kalayan éksprési protéin ribosom anu handap. Kami ngaksés data anu diterbitkeun ku Izar et al. (16), kalebet panyisipan t-SNE-na, tiasa ngontrol tumpang tindih éksprési antara pananda sél imun sareng éksprési NNMT.
PBMC dipisahkeun tina produk pamisahan leukosit (STEMCELL Technologies) ku sentrifugasi kapadetan gradien Ficoll. Sél CD3 + diisolasi tina PBMC nganggo manik-manik CD3 (Miltenyi). Kalayan ayana atanapi henteuna MNA, sél CD3 + diaktipkeun ku CD3 anu kaiket ku pelat (5μg/ml), CD28 anu leyur (3μg/ml) sareng IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Dina dinten terakhir ékspansi, viabilitas (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) sareng proliferasi (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) dievaluasi ku flow cytometry. Évaluasi fungsi éféktor ku cara ngarangsang sél nganggo PMA (20 ng/ml) sareng ionomisin (1μg/ml) nganggo GolgiStop salami 4 jam, teras monitor CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) sareng TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Stimulasi sél qPCR sareng ChIP nganggo PMA (20 ng/ml) sareng ionomisin (1μg/ml) salami 4 jam. Supernatan ELISA dikumpulkeun sateuacan sareng saatos stimulasi nganggo PMA (20 ng/ml) sareng ionomisin (1 μg/ml) salami 4 jam.
Turutan protokol produsén pikeun ngasingkeun RNA nganggo RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Anggo QIAshredder (QIAGEN) pikeun ngahomogenisasi sampel. Anggo kit RNA ka cDNA kapasitas luhur (Thermo Fisher Scientific) pikeun nyintésis DNA komplementer (cDNA). Anggo TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) pikeun ngitung éksprési gén (numutkeun protokol produsén) nganggo probe ieu: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldehida-3-fosfat tina Hidrogén (GAPDH)] sareng Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampel-sampelna dijalankeun dina sistem PCR real-time StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) dina pelat réaksi 96-sumur optik gancang MicroAmp (Applied Biosystems) nganggo pilem optik MicroAmp. Nilai Ct naon waé anu ngaleuwihan 35 dianggap di luhur ambang deteksi sareng ditandaan salaku teu tiasa dideteksi.
Laksanakeun ChIP sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna (58). Singkatna, sél-sél dirawat ku formaldehida (konsentrasi ahir 1,42%) sareng diinkubasi dina suhu kamar salami 10 menit. Anggo buffer pembengkakan anu ditambah (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl sareng 0,1% NP-40) dina és salami 10 menit, teras suspénsikeun deui dina buffer imunoprésipitasi sapertos anu dijelaskeun (58). Sampel teras disonikasi ku siklus ieu: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) sareng waktos statis 40 detik. Inkubasi antibodi imunoglobulin G kelas ChIP (Téhnologi Sinyal Sel; 1μl), histon H3 (Téhnologi Sinyal Sel; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) sareng SP1 (Téhnologi Sinyal Sel; 3μl) sareng sampel dina kocok 4°CC sapeuting. Inkubasi manik-manik protéin A (Thermo Fisher Scientific) sareng sampel dina suhu 4°C kalayan diocok lalaunan salami 1 jam, teras anggo manik-manik chelex (Bio-Rad) pikeun ngabeungharan DNA, sareng anggo protéinase K (Thermo Fisher) pikeun nyerna protéin. Promotor TNFα dideteksi ku PCR: maju, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sabalikna, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produk 207-bp). Gambar-gambar dihasilkeun ku Image Lab (Bio-Rad) sareng diukur nganggo parangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sél dikumpulkeun sapertos anu dijelaskeun di luhur. Panangtuan dilaksanakeun numutkeun prosedur produsén pikeun kit TNFα ELISA manusa (Invitrogen), kit IL-2 ELISA manusa (Invitrogen) sareng kit IFN-γ ELISA manusa (Abcam). Numutkeun protokol produsén, supernatan diéncérkeun 1:100 pikeun ngadeteksi TNFα sareng IL-2, sareng 1:3 pikeun ngadeteksi IFN-γ. Anggo EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) pikeun ngukur absorbansi dina 450 nm.
PBMC dipisahkeun tina produk pamisahan leukosit (STEMCELL Technologies) ku sentrifugasi kapadetan gradien Ficoll. Sél CD3 + diisolasi tina PBMC nganggo manik-manik CD3 (Miltenyi). Kalayan ayana atanapi henteuna MNA, sél CD3 + diaktipkeun ku CD3 anu kaiket ku pelat (5μg/ml), CD28 anu leyur (3μg/ml) sareng IL-2 (300 U/ml; Proleukin) salami 3 dinten. Saatos 3 dinten, sél dikumpulkeun sareng dikumbah ku saline 0,9%, sareng pelet dibekukeun. Cacah sél dilakukeun ku sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) nganggo 123count eBeads.
Métabolit ékstrak sakumaha anu dijelaskeun di luhur. Ékstrak garing dibentuk deui dina konsentrasi 4000 ékivalén sél/μl. Analisis sampel ku kromatografi fase tibalik (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) sareng kolom CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori 120-Å; #186008500, Waters). Spektrométer massa polar (6470, Agilent), dimana ionisasi éléktrospray beroperasi dina modeu positif. Fase gerak A nyaéta 0,1% asam format (dina H2O), fase gerak B nyaéta 90% asetonitril, 0,1% asam format. Gradien LC nyaéta 0 nepi ka 2 menit pikeun 100% A, 2 nepi ka 7,1 menit pikeun 99% B, sareng 7,1 nepi ka 8 menit pikeun 99% B. Teras imbangan deui kolom sareng fase gerak A dina laju aliran 0,6 ml/mnt salami 3 menit. . Laju aliran nyaéta 0,4ml/mnt, sareng ruang kolom dipanaskeun dugi ka 50°C. Anggo standar kimia murni MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) pikeun nangtukeun waktos ingetan (RT) sareng transformasi (RT = 0,882 menit, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137→92, Konversi 3 = 137→78). Nalika sadaya tilu transisi lumangsung dina waktos ingetan anu leres, transisi 1 dianggo pikeun kuantifikasi pikeun mastikeun spésifisitas. Kurva standar MNA (Toronto Research Chemical Company) dihasilkeun ku genep pangenceran serial tina larutan stok (1 mg/ml) pikeun kéngingkeun standar 0,1, 1,0, 10 sareng 100 ng/ml sareng 1,0 sareng 10μg/ml masing-masing cair. Wates deteksi nyaéta 1 ng/ml, sareng réspon linier nyaéta antara 10 ng/ml sareng 10μg/ml. Unggal suntikan dua mikroliter sampel sareng standar dianggo pikeun analisis LC/MS, sareng sampel kontrol kualitas campuran dijalankeun unggal dalapan suntikan pikeun mastikeun stabilitas platform analisis. Réspon MNA tina sadaya sampel sél anu dirawat MNA aya dina rentang linier uji. Analisis data dilakukeun nganggo parangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruk αFR-CAR generasi kadua dicandak tina Song et al. (59). Singkatna, konstruk ieu ngandung eusi ieu: runtuyan pamimpin CD8a, fragmen variabel ranté tunggal spésifik αFR manusa, daérah engsel sareng transmembran CD8a, domain intraseluler CD27 sareng domain intraseluler CD3z. Runtuyan CAR lengkep disintésis ku GenScript, teras diklon kana véktor éksprési lentiviral generasi kadua di hulu kaset éksprési GFP anu dianggo pikeun meunteun efisiensi transduksi.
Lentivirus dihasilkeun ku transfeksi sél HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); dipelak dina média Dulbecco's modified Eagle anu ngandung 10% sérum sapi fétal (FBS) sareng 1% PenStrep, sareng nganggo vektor CAR-GFP sareng plasmid kemasan (psPAX2 sareng pMD2.G, Addgene) nganggo lipofection amine (Sigma-Aldrich). Supernatan anu ngandung virus dikumpulkeun 48 sareng 72 jam saatos transfeksi, disaring, sareng dipekatkeun ku ultrasentrifugasi. Simpen supernatan virus anu dipekatkeun dina suhu -80°C dugi ka transduksi.
PBMC dipisahkeun tina produk pamisahan leukosit donor séhat (STEMCELL Technologies) ku sentrifugasi kapadetan gradien Ficoll. Anggo microbeads CD8 seleksi positif (Miltenyi) pikeun ngasingkeun sél CD8+ tina PBMC. Stimulasi sél T nganggo TransAct (Miltenyi) sareng dina média TexMACS [Miltenyi; ditambah ku 3% sérum manusa anu diinaktivasi panas, 1% PenStrep sareng IL-2 (300 U/ml)]. Dua puluh opat jam saatos stimulasi, sél T ditransduksi ku lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sél). 1 dugi ka 3 dinten saatos transduksi dina Cytek Aurora (dina FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), évaluasi éksprési GFP sél pikeun nunjukkeun efisiensi transduksi sahenteuna 30%.
Sél CAR-T dikultur salami 24 jam dina Immunocult (STEMCELL Technologies; ditambahan ku 1% PenStrep) dina kaayaan ieu: teu diubaran, diubaran ku 250 μM adénosin atanapi 10 mM MNA. Saatos perlakuan awal, sél CAR-T dikumbah ku PBS sareng digabungkeun sareng 20.000 sél SK-OV-3 [ATCC; dina média McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ditambahan ku 10% FBS sareng 1% PenStrep dina 10: Babandingan éféktor ka target 1 diamplifikasi dina rangkep tilu dina média Immunocult anu ditambahan. Sél SK-OV-3 sareng sél SK-OV-3 anu dilisis ku saponin digitalis (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) dianggo salaku kontrol négatip sareng positip, masing-masing. Saatos 24 jam ko-kultivasi, supernatan dikumpulkeun sareng laktat dehidrogenase (LDH) diukur numutkeun pitunjuk produsén (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatan LDH diéncérkeun 1:50 dina buffer LDH. Persentase pembunuhan diukur nganggo rumus ieu: persentase pembunuhan = persentase koreksi / laju pembunuhan maksimum x 100%, dimana persentase koreksi = ko-kultur-sél T hungkul, sareng laju pembunuhan maksimum = kontrol positif-kontrol négatif.
Sakumaha anu dijelaskeun dina téks atanapi bahan sareng metode, anggo GraphPad Prism 8, Microsoft Excel atanapi R v3.6.0 pikeun analisis statistik. Upami sababaraha sampel dikumpulkeun ti pasien anu sami (sapertos ascites sareng tumor), urang nganggo uji t anu dipasangkeun atanapi ngalebetkeun pasien salaku pangaruh acak dina modél linier atanapi umum upami diperyogikeun. Pikeun analisis metabolomik, uji pentingna dilakukeun dina rangkap tilu.
Kanggo bahan tambahan pikeun tulisan ieu, mangga tingali http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ieu mangrupikeun artikel aksés kabuka anu disebarkeun dina istilah Lisénsi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, anu ngamungkinkeun panggunaan, distribusi sareng réproduksi dina média naon waé, salami panggunaan akhir sanés pikeun kauntungan komérsial sareng premisna nyaéta karya aslina leres. Rujukan.
Catetan: Kami ngan ukur nyuhunkeun anjeun pikeun masihan alamat email anjeun supados jalmi anu anjeun rekomendasikeun ka halaman éta terang yén anjeun hoyong aranjeunna ningali email éta sareng éta sanés spam. Kami moal ngarékam alamat email naon waé.
Patarosan ieu dianggo pikeun nguji naha anjeun pangunjung sareng nyegah kiriman spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi J. Jones), De Bellardini (GBerardi J. Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA nyumbang kana suprési imun sél T sareng ngagambarkeun target imunoterapi poténsial pikeun pengobatan kanker manusa.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi J. Jones), De Bellardini (GBerardi J. Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA nyumbang kana suprési imun sél T sareng ngagambarkeun target imunoterapi poténsial pikeun pengobatan kanker manusa.
© 2021 Asosiasi Amérika pikeun Kamajuan Élmu. sadaya hak disimpen. AAAS mangrupikeun mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef sareng COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.