Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman modeu kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal nampilkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Teu siga vertebrata, serangga sacara lega dianggap kakurangan hormon stéroid séks anu bias ka lalaki. Dina Anopheles gambiae, stéroid ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) sigana parantos mekar pikeun ngontrol kamekaran endog nalika disintésis ku bikang2 sareng pikeun ngainduksi période refraktori kawin nalika ditransfer sacara séksual ku jalu3. Kusabab kamekaran endog sareng kawin mangrupikeun sipat réproduktif anu penting, ngartos kumaha reungit Anopheles bikang ngahijikeun sinyal hormonal ieu tiasa ngagampangkeun desain program kontrol malaria énggal. Di dieu, urang ngungkabkeun yén fungsi réproduktif ieu diatur ku stéroid séks anu béda ngaliwatan jaringan kompléks énzim anu ngaktipkeun/nganonaktipkeun ecdysteroid. Kami ngaidentipikasi ecdysone teroksidasi spésifik jalu, 3-dehydro-20E (3D20E), anu ngajaga parentage ku cara mareuman panarimaan séksual awéwé saatos transfer séksual sareng aktivasina ku dephosphorylation. Utamana, transfer 3D20E ogé ngainduksi éksprési gén réproduktif anu ngajaga kamekaran endog salami inféksi Plasmodium, mastikeun kaséhatan bikang anu kainféksi. 20E anu diturunkeun ti bikang henteu nimbulkeun hubungan séksual réspon, tapi ngamungkinkeun individu anu kawin pikeun ngendog saatos kinase anu ngahambat 20E dihambat. Idéntifikasi hormon stéroid serangga spésifik jalu ieu sareng peranna dina ngatur réséptivitas séksual awéwé, kasuburan sareng interaksi sareng Plasmodium nunjukkeun poténsi pikeun ngirangan kasuksésan réproduktif reungit anu nularkeun malaria.
Kasus malaria sareng maotna nuju ningkat deui4 kusabab résistansi inséktisida anu nyebar dina reungit Anopheles, hiji-hijina vektor parasit malaria manusa. Biologi kawin reungit ieu mangrupikeun target anu pikaresepeun pikeun intervensi kontrol malaria anyar sabab bikangna ngan ukur kawin sakali5; ngajantenkeun kajadian kawin tunggal ieu steril bakal gaduh poténsi anu ageung pikeun ngirangan populasi reungit di lapangan.
Awéwé jadi teu mampuh sacara séksual saatos nampi hormon stéroid anu luhur ti lalaki. Panilitian nunjukkeun yén panyabab kasusah dina kawin salajengna nyaéta 20-hydroxyecdysone (20E), hormon stéroid anu langkung dikenal salaku régulator siklus molting dina tahap larva. Kamampuh jalu pikeun nyintésis sareng mindahkeun 20E parantos mekar khususna dina spésiés Anopheles anu mangrupikeun bagian tina subgenus Cellia7, anu sumebar di Afrika sareng kalebet vektor malaria anu paling bahaya, kalebet Anopheles gambiae. Ieu khususna penting sabab dina spésiés ieu bikang ogé ngahasilkeun 20E saatos unggal tuang getih, sareng 20E ngadorong siklus oogenesis (tingali ref. 8). Nanging, sakedik anu dipikanyaho ngeunaan cara bikang ngahijikeun sinyal tina dua sumber ecdysone anu béda (induksi transfer jalu sareng tuang getih) tanpa ngorbankeun kamampuan sorangan pikeun kawin. Nyatana, upami 20E anu dihasilkeun ku bikang micu intoleransi séksual, ieu bakal nyababkeun infertilitas dina individu anu tuang parawan, paripolah anu umum pisan dina reungit ieu5.
Hiji katerangan anu mungkin nyaéta A. gambiae jalu mindahkeun ékdison spésifik jalu anu dimodifikasi, anu ngaktipkeun kaskade sinyal dina saluran réproduktif bikang, anu ngahasilkeun ketidakstabilan kawin. Nanging, sanaos vertebrata gaduh sababaraha hormon stéroid, sapertos éstrogén sareng androgén (diulas dina ref. 9), numutkeun pangaweruh urang, stéroid anu bias androgén teu acan diidentifikasi dina serangga.
Kami ngamimitian pikeun nangtukeun répertoar hormon stéroid dina kelenjar aksésori jalu jalu (MAG) tina A. gambiae anu dewasa sacara séksual pikeun milarian stéroid anu tiasa ngarobih. Nganggo kromatografi cair kinerja tinggi digabungkeun sareng spéktrométri massa tandem (HPLC-MS/MS) tinimbang metode anu kirang spésifik anu dianggo sateuacanna, kami ngadeteksi ékdison (E) sareng 20E dina jaringan ieu, anu mastikeun hasil sateuacanna. Nanging, sampelna didominasi ku stéroid terfosforilasi teroksidasi, saluyu sareng rumus 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Gambar 1). Bentuk sanésna kalebet 3-dehidro-20E (3D20E) sareng 20E-22-fosfat (20E22P). Inténsitas sinyal HPLC-MS/MS tina 3D20E22P dua kali langkung luhur tibatan bentuk anu didefosforilasi, 3D20E, sareng tilu kali langkung luhur tibatan E sareng 20E (Gambar 1). Sanaos di bagian awak anu sanés sareng saluran réproduktif handap (LRT; Gambar Data Tambahan 1a). Kami ogé nganalisis ékdisteroid dina jalu sareng bikang anu nembé ditutup (umur <1 dinten) sareng ngadeteksi 3D20E sareng 3D20E22P ngan ukur dina MAG; E, 20E sareng 20E22P aya dina duanana jenis kelamin (Gambar Data Tambahan 1b). Data ieu nunjukkeun yén jalu déwasa A. gambiae ngahasilkeun titer hormon modifikasi anu luhur dina MAG-na anu henteu disintésis ku bikang.
MAG sareng LRT bikang (kalebet atrium, vesikula mani, sareng parovarium) dibedah tina jalu parawan umur 4 dinten (umur 4 dinten) sareng bikang parawan sareng anu dikawinkeun (0,5, 3, sareng 12 hpm). Ékdison dina jaringan ieu dianalisis ku HPLC-MS/MS (rata-rata ± sem; uji-t anu teu dipasangkeun, dua sisi, laju panemuan palsu (FDR) dikoréksi; NS, henteu signifikan; *P < 0,05, **P < 0,01 . 3D20E: 3 jam vs. 0,5 jam, P = 0,035; 12 jam vs. 3 jam, P = 0,0015; 12 jam vs. 0,5 jam, P = 0,030. 3D20E22P: 3 jam vs. 0,5 jam, P = 0,25; 12 jam vs. 3 jam, P = 0,0032; 12 jam vs. 0,5 jam, P = 0,015). Data asalna tina tilu réplikasi biologis. Area puncak pikeun unggal ecdysone anu dipikaresep diitung sareng dinormalisasi ku jumlah reungit. Ecdysone digambarkeun ku warna sapertos kieu: E, héjo; 20E, oranyeu; 20E22P, wungu; 3D20E, biru; 3D20E22P, pink. Sisipan ningkatkeun skala dina sumbu-y pikeun nunjukkeun tingkat ecdysone anu langkung handap.
Pikeun nalungtik naha 3D20E22P sareng 3D20E ditransfer nalika kawin, kami ngabedah LRT bikang dina sababaraha titik waktos saatos kawin. Sanaos ecdysone henteu kapendak dina parawan, kami niténan jumlah anu ageung 3D20E22P dina LRT langsung saatos kawin (0,5 jam saatos kawin, hpm), turun kana waktosna, sedengkeun tingkat 3D20E ningkat sacara signifikan (Gambar 1). Nganggo 3D20E anu disintésis sacara kimiawi salaku standar, kami nangtukeun yén tingkat hormon stéroid ieu dina LRT kawin sahenteuna 100 kali langkung luhur tibatan 20E (Tabel Data Tambahan 1). Janten, 3D20E22P nyaéta ecdysone jalu utama anu ditransfer ka LRT bikang nalika kawin, sareng bentuk defosforilasi na, 3D20E, janten seueur pisan teu lami saatos kawin. Ieu nunjukkeun peran penting pikeun ecdysone anu terakhir dina biologi pasca kawin bikang.
Saatos ngahasilkeun kumpulan data sekuensing RNA (RNA-seq) anyar (Gambar 2a), nganggo pipa bioinformatika anu didamel khusus, kami milarian ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), sareng ecdysone anu ngodekeun gén fosfatase anu dimodifikasi 20E. EPP) diekspresikan dina jaringan réproduktif. Kami ngaidentipikasi hiji calon gén EPP sareng dua calon gén EcK (EcK1 sareng EcK2), tapi teu tiasa mendakan calon gén EO anu saé. Khususna, gén EPP individu diekspresikan dina tingkat anu luhur (persentil ka-98,9) dina MAG Gambia tapi henteu dina LRT awéwé (Gambar 2b), sabalikna tina ekspektasi kami kumargi defosforilasi 3D20E22P kajantenan dina jaringan awéwé ieu. Ku alatan éta, kami yakin yén EPP jalu tiasa ditransfer nalika kawin. Memang, kami nganggo panyiri isotop stabil in vivo pikeun nutupan protéin awéwé saatos kawin, énzim anu diidentipikasi ku MS dina atrium awéwé (Gambar 2c sareng Tabel Tambahan 1). Ayana EPP dina MAG sareng LRT bikang anu dikawinkeun (tapi sanés parawan) ogé dikonfirmasi nganggo antibodi spésifik (Gambar 2d).
a, Pipa bioinformatika anu didamel khusus pikeun milarian jaringan réproduktif unggal jenis kelamin pikeun gén anu ngodekeun EcKs, EOs, sareng EPPs. Angka-angka di gigireun panah nunjukkeun jumlah calon lalaki sareng awéwé dina unggal léngkah. Analisis ieu ngaidentipikasi hiji gén EPP (EPP) sareng hiji gén EcK (EcK1) anu diekspresikeun dina lalaki, sareng hiji gén EcK (EcK2) anu diekspresikeun dina duanana jenis kelamin tapi henteu ngahasilkeun calon gén EO. b, Peta panas ngabandingkeun éksprési gén calon dina jaringan Anopheles gambiae sareng Anopheles albicans anu masih kénéh virgin (V) sareng kawin (M). Spca, fértilisasi; MAGs, kelenjar aksésoris dina lalaki; bagian awak anu sanés, kalebet payudara, jangjang, suku, awak anu gendut, sareng organ internal dina dua jinis kelamin, sareng ovarium dina awéwé. EcK2 diekspresikan pisan dina MAG sareng atrium Gambia, sedengkeun EPP ngan ukur kapanggih dina MAG.c, Analisis protéomik tina translokasi grup éjakulasi lalaki kana atrium awéwé dina 3, 12 sareng 24 hpm, nunjukkeun 67 protéin anu paling seueur. Bikang digedékeun dina diet anu ngandung 15N pikeun ngalabel (sareng nutupan) sadaya protéin. Jalu anu teu ditandaan dikawinkeun sareng bikang anu ditandaan, sareng LRT awéwé dibedah dina 3, 12 sareng 24 hpm pikeun analisis protéomik (tingali Tabel Tambahan 1 pikeun daptar lengkep protéin éjakulasi). Inset, EPP, Eck1 sareng EcK2 dideteksi dina MAG jalu parawan ku analisis protéomik jaringan ieu.d, EPP dideteksi ku western blot dina MAG sareng LRT bikang anu dikawinkeun, tapi henteu dina bikang parawan atanapi jalu atanapi sésana awak awéwé. Mémbran sacara babarengan diuji ku antibodi anti-aktin (kontrol pemuatan) sareng anti-EPP. Sadaya jalu masih parawan. Tingali Gambar Tambahan 1 pikeun data sumber gél. Western blots dilakukeun dua kali kalayan hasil anu sami.
Aktivitas fosfofosfatase ékdisteroid tina EPP diverifikasi saatos inkubasi ku HPLC-MS/MS sareng 3D20E22P anu diisolasi tina MAG (Gambar Data Tambahan 2a). Salajengna, nalika urang ngaredam EPP ku gangguan anu dimediasi RNA (RNAi), urang ngadeteksi réduksi anu kuat dina aktivitas fosfatase dina jaringan réproduktif jalu ieu (Gambar 3a), sareng bikang anu dikawinkeun sareng jalu anu diredam EPP nunjukkeun proporsi 3D20E anu didefosforilasi A anu langkung handap (Gambar 3b) sanaos ngaredam gén parsial (Gambar Data Tambahan 2b, c). Sabalikna, urang henteu ngadeteksi parobahan anu signifikan dina rasio 20E22P/20E dina reungit anu sami, anu tiasa nunjukkeun yén énzim éta khusus pikeun 3D20E22P (Gambar 3b).
a, Aktivitas fosfatase anu turun dina MAG disababkeun ku panyabutan EPP nganggo kontrol EPP RNA untaian ganda (dsEPP) atanapi GFP RNA untaian ganda (dsGFP). Dua puluh kolam MAG dianggo dina unggal réplikasi (P = 0,0046, uji-t pasangan, dua sisi), digambarkeun ku titik-titik anu misah. b, Bikang anu dikawinkeun sareng jalu anu dibungkem EPP gaduh proporsi 3D20E anu didefosforilasi sacara signifikan langkung handap dina 3 hpm (P = 0,0043, uji-t anu teu dipasangkan, dua sisi), sedengkeun tingkat 20E teu kapangaruhan (P = 0,063, teu dipasangkan). t-test, dua sisi). Data dipidangkeun salaku rata-rata ± sem tina tilu kolam anu masing-masing 13, 16 sareng 19 bikang. c, Bikang anu dikawinkeun sareng jalu anu dibungkem EPP ngagaduhan tingkat kawin deui anu langkung luhur (P = 0,0002, uji pasti Fisher, dua sisi). Bikang mimitina kapaksa kawin pikeun mastikeun status kawinna; 2 dinten saatosna, aranjeunna dihubungikeun sareng jalu sanés anu mawa spérma transgenik pikeun meunteun tingkat kawin deui ku deteksi PCR kuantitatif tina transgén.d, Bikang anu dibéré getih anu dikawinkeun sareng jalu anu dibungkem EPP ngagaduhan kasuburan anu turun sacara signifikan (P < 0,0001; tés Mann-Whitney, dua sisi) sareng jumlah endog anu rada turun (P = 0,088, tés Mann-Whitney, dua sisi), sedengkeun tingkat pemijahan henteu kapangaruhan (P = 0,94, tés pasti Fisher, dua sisi). Dina sadaya panel, n ngagambarkeun jumlah sampel reungit anu sacara biologis mandiri.NS, henteu signifikan.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Salajengna, urang meunteun naha defosforilasi ekdison penting pikeun nimbulkeun résistansi kawin dina bikang. Utamana, bikang anu kawin sareng jalu anu kakurangan EPP kawin deui dina frékuénsi anu langkung luhur (44,9%) tibatan bikang kontrol (10,4%) nalika kakeunaan jalu (transgenik) tambahan (Gambar 3c). Kami ogé niténan panurunan anu signifikan dina kasuburan (Gambar 3d, kénca) sareng panurunan sakedik dina jumlah endog anu ditetepkeun ku bikang ieu (Gambar 3d, tengah), sedengkeun persentase endog anu ditetepkeun ku bikang (réspon sanés anu ditimbulkeun dina bikang ku kawin)) henteu kapangaruhan (Gambar 3d, katuhu). Kusabab spésifisitas EPP anu dititénan pikeun 3D20E22P, hasil ieu nunjukkeun yén aktivasina 3D20E ku EPP anu ditransfer nalika kawin tiasa gaduh peran penting dina mareuman réséptivitas bikang kana kawin salajengna, paripolah anu sateuacanna disababkeun ku transfer séksual 20E. Ku alatan éta, hormon spésifik lalaki ieu ogé mangaruhan pisan kasuburan awéwé.
Salajengna, urang ngabandingkeun kagiatan 20E sareng 3D20E dina ékspérimén suntikan dina parawan anu dewasa sacara séksual nganggo 3D20E anu disintésis sacara kimiawi (Gambar 4a–c) sareng 20E anu sayogi sacara komersil. Urang niténan yén 3D20E sacara signifikan langkung efektif tibatan 20E dina mareuman sensitivitas bikang kana kawin dina dua konsentrasi (Gambar 4d). Anu penting, satengah tingkat fisiologis 3D20E dina LRT (1.066 pg pasca-suntikan vs. 2.022 pg pasca-kawin) ngainduksi proporsi bikang refraktori anu 20 kali langkung luhur tibatan tingkat fisiologis 20E (361 pg pasca-suntikan) 24 jam saatos suntikan dina konsentrasi pangluhurna 18 pg pasca-kawin; Tabel Data Tambahan 1). Hasil ieu saluyu sareng anggapan yén transfer séksual 20E henteu nyababkeun période refraktori kawin, sareng salajengna nunjukkeun 3D20E salaku faktor utama dina mastikeun hubungan kolot-anak. 3D20E ogé sacara signifikan langkung aktip tibatan 20E dina uji endog dina bikang parawan (Gambar 4e), nunjukkeun yén laju endog normal anu kami tingali saatos panyabutan EPP parsial disababkeun ku ayana aktivitas 3D20E sésa anu masih dihasilkeun ku faktor bikang anu diinduksi kawin.
(a,b) 3D20E disintésis sacara kimiawi tina 20E (a) kalayan konvérsi/efisiensi anu luhur pisan (data anu dipidangkeun salaku rata-rata ± sem tina tilu réaksi sintésis mandiri) (b).c, Spéktrum massa (satengah handap) persis cocog sareng ecdysone anu kapanggih dina LRT bikang anu dikawinkeun (satengah luhur).d, Dibandingkeun sareng 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Tés pasti Fisher, dua sisi) sareng 10% étanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Tés pasti Fisher, 2 sisi), sedengkeun 20E sacara signifikan langkung luhur tibatan kontrol ngan ukur dina dosis anu langkung luhur (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Tés pasti Fisher, 2 sisi).e, Suntikan 3D20E ngainduksi laju pemijahan anu langkung luhur sacara signifikan dina bikang parawan tibatan kontrol étanol 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Tés pasti Fisher, dua sisi), sedengkeun 20E dibandingkeun sareng kontrol Ngan dina dosis anu langkung luhur (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Tés pasti Fisher, dua sisi). 3D20E ngainduksi laju pemijahan anu langkung luhur sacara signifikan tibatan 20E dina dosis anu langkung luhur (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Tés pasti Fisher, dua sisi). Dina sadaya panel, n ngagambarkeun jumlah sampel reungit anu sacara biologis mandiri. NS, henteu signifikan. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0.001. Data asalna tina tilu ulangan.
Dina panilitian sateuacana, urang nangtukeun yén transfer séksual hormon stéroid ngainduksi éksprési MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), gén réproduktif awéwé anu ngajaga bikang A. gambiae tina inféksi P. falciparum. Biaya kaséhatan anu disababkeun ku 13, parasit malaria manusa anu paling bahaya. Kusabab pentingna MISO pikeun kabugaran réproduktif Anopheles di daérah endemik malaria, urang mutuskeun pikeun nangtukeun hormon mana 3D20E atanapi 20E anu micu éksprési gén ieu. Kami mendakan yén sedengkeun suntikan 20E sacara khusus atanapi langkung kuat ngainduksi sababaraha reséptor hormon nuklir (HR), sapertos HR3 sareng HR4, sareng target stéroid hilir has, sapertos gén yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO langkung kuat diinduksi ku 3D20E (Extended Data Fig. 3). Ku kituna, transfer séksual hormon stéroid androgenik ieu sigana ngainduksi mékanisme anu ngajaga bikang tina biaya anu disababkeun ku inféksi parasit. Salajengna, 3D20E sacara béda mangaruhan duanana isoform tina Reséptor E EcR, ngainduksi EcR-A sareng nindes EcR-B, sareng langkung kuat micu gén-gén anu ngainduksi kawin anu sanés, kalebet HPX15, anu mangaruhan kasuburan awéwé. Ieu tiasa ngajelaskeun infertilitas anu signifikan anu dititénan dina awéwé anu dikawinkeun sareng lalaki anu dibungkem EPP (Gambar Data Tambahan 3). Data ieu nunjukkeun ayana jalur hilir anu langkung dipikaresep diaktipkeun ku dua hormon ecdysone anu tiasa janten dasar fungsi khusus séks.
Salajengna, urang nguji fungsi dua gén EcK anu diidentipikasi dina pipa bioinformatika urang. Ngaheureuyan EcK1 atanapi EcK2 nyababkeun mortalitas anu signifikan dina lalaki (Gambar Data Tambahan 4a), nunjukkeun yén fosforilasi ecdysone, sareng ku kituna inaktivasi, penting pikeun salamet. Kusabab EcK2 diekspresikan dina tingkat anu langkung luhur tibatan EcK1 sareng dideteksi dina MAG ku protéomik (Gambar 2b, c sareng Tabel Tambahan 2), urang ngavalidasi aktivitas kinase ecdysteroid na ku cara ngainkubasi éta sareng 20E, anu ngahasilkeun fosforilasi 20E22P (Gambar Data Tambahan 2).4b). Nalika nganggo 3D20E salaku substrat, urang henteu tiasa ngadeteksi produk terfosforilasi 3D20E22P (Gambar Data Tambahan 4c), nunjukkeun yén 20E tinimbang 3D20E tiasa janten target anu dipikaresep ku EcK2.
Numutkeun analisis RNA-seq kami, EcK2 ogé diekspresikan pisan dina LRT bikang parawan, dimana éta dipareuman saatos kawin (Gambar 2b). Kami mastikeun data ieu sareng nangtukeun yén éksprési EcK2 henteu kapangaruhan ku tuang getih (Gambar Data Tambahan 5a). Ngalegaan ékspérimén MS awal kami, kami nangtukeun yén puncak 20E22P raket patalina sareng puncak 20E (22-26 jam saatos tuang getih; Gambar Data Tambahan 5b). Ngareureuhkeun EcK2 dina bikang parawan nyababkeun paningkatan 3 kali lipat dina babandingan relatif 20E ka 20E22P dina 26 jam saatos tuang getih (Gambar Data Tambahan 2c sareng 5c), mastikeun yén EcK2 ogé ngafosforilasi 20E dina bikang. Utamana, parawan anu béak EcK2 ngajaga réséptivitas séksual pinuh (Gambar Data Tambahan 5d, e), salajengna nunjukkeun yén produksi bikang 20E henteu ngainduksi période refraktori kawin. Nanging, bikang ieu ngagaduhan tingkat ngendog anu ningkat sacara signifikan dibandingkeun sareng kontrol, kalayan langkung ti 30% parawan ngendog (Gambar Data Tambahan 5f). Upami suntikan RNA Eck2 untaian ganda (dsEcK2) dilakukeun saatos tuang getih, pemijahan henteu kajantenan, dina titik éta puncak 20E kusabab asupan getih parantos turun. Sacara umum, hasil ieu ngadukung modél yén 20E anu dihasilkeun saatos nyedot getih tiasa ngainduksi pemijahan, tapi ngan ukur nalika blok pemijahan (EcK2 sareng kamungkinan faktor sanésna) dipareuman ku kawin. Suntikan 20E atanapi 3D20E henteu ngahambat éksprési EcK2 dina parawan (Gambar Data Tambahan 5g), nunjukkeun yén faktor sanés ngamediasi inhibisi kinase ieu. Nanging, tingkat 20E saatos tuang getih henteu cekap pikeun ngainduksi rasa teu nyaman kawin, tapi sacara efektif dipicu ku titer anu luhur tina 3D20E anu ditransfer sacara séksual.
Hasil panalungtikan kami nyayogikeun wawasan penting kana mékanisme anu ngatur kasuksésan réproduktif A. gambiae. Modél parantos muncul dimana jalu parantos mekar pikeun nyintésis titer 3D20E anu luhur, ékdison anu dirobih khusus lalaki anu mastikeun parentage ku cara ngadesensitisasi bikang pikeun kawin salajengna. Dina waktos anu sami, véktor malaria ieu ogé parantos mekarkeun sistem anu efisien pikeun ngaktipkeun 3D20E dina bikang salaku réspon kana transfer séksual EPP khusus lalaki. Numutkeun pangaweruh kami, ieu mangrupikeun conto munggaran sistem hormon stéroid anu didominasi lalaki sareng awéwé anu ngalaksanakeun fungsi anu unik sareng kritis dina serangga. Fungsi ékdison khusus lalaki parantos dipostulasikeun tapi henteu didemonstrasikeun sacara definitif. Salaku conto, hipotesis anu seueur dibantah 18 nyaéta fungsi ieu tiasa dilakukeun ku prékursor 20E E1. Éta dipikanyaho sacara umum yén dina Drosophila, monandry dipicu ku transfer séksual péptida séks leutik 19,20 anu berinteraksi sareng neuron anu ngainternalisasi saluran réproduktif awéwé ngalangkungan reséptor péptida séks khusus 21,22. Karya salajengna diperyogikeun pikeun nangtukeun sinyal hilir kaskade anu dikontrol ku 3D20E dina bikang A. gambiae sareng pikeun nangtukeun naha kaskade ieu tiasa dilestarikan antara reungit sareng Drosophila.
Kusabab peran penting 3D20E dina kasuburan sareng paripolah awéwé anu diidentipikasi dina panilitian kami, jalur anu ngarah kana sintésis sareng aktivasina 3D20E nawiskeun kasempetan énggal pikeun strategi kontrol reungit ka hareup, sapertos generasi jalu steril kompetitif dina strategi téknologi serangga steril Dianggo pikeun pelepasan liar atanapi pikeun niru 3D20E dina kaulinan parawan. Fungsi spésifik jalu 3D20E panginten parantos mekar nalika A. gambiae sareng spésiés Cellia anu sanés ngagaduhan kamampuan pikeun ngakoagulasi mani kana colokan kawin, sabab ieu ngamungkinkeun transfer anu efisien tina sajumlah ageung hormon sareng énzim anu ngaktifkeun hormon. Kahareupna, évolusi 3D20E anu ngalaksanakeun monandry nyayogikeun mékanisme pikeun bikang (ngaliwatan éksprési MISO anu luhur) pikeun ngadukung kabugaran réproduktifna di daérah prévalénsi malaria anu luhur, anu sacara teu langsung nyumbang kana panularan Plasmodium. Kusabab 20E bikang parantos dipidangkeun gaduh pangaruh anu ageung kana salamet sareng kamekaran P. falciparum dina reungit Anopheles bikang,24 jalur hormon stéroid jalu sareng bikang ayeuna janten aspék konci interaksi reungit-parasit.
Galur A. gambiae G3 diingu dina kaayaan serangga standar (26-28 °C, kalembaban relatif 65-80%, fotoperiode caang/poék 12:12 jam). Larva dibéré dahareun lauk bubuk (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets sareng Tetra Pond Sticks dina babandingan 7:7:2). Reungit déwasa dibéré larutan dekstrosa 10% ad libitum sareng getih manusa mingguan (nalungtik komponén getih). Reungit parawan diala ku cara misahkeun jenis kelamin dina tahap pupa saatos nalungtik tungtung ku mikroskop. Reungit jalu anu mawa transgen DsRed parantos dijelaskeun sateuacanna.
Ékspérimén kawin paksa dilaksanakeun dumasar kana protokol anu parantos dijelaskeun sateuacanna. Pikeun kawin alami, bikang parawan umur 4 dinten dijaga dina babandingan 1:3 sareng jalu parawan anu dewasa sacara séksual salami dua wengi. Pikeun ékspérimén dimana jalu disuntik ku dsEPP, ko-kandang babarengan sareng dinten ka-3-4 saatos suntikan, nalika aktivitas fosfatase dibungkem sacara maksimal (Gambar Data Tambahan 2b).
Jaringan reungit, sésa mayit (sésa awak), atanapi sakujur awak dibedah kana 100% metanol sareng dihomogenisasi nganggo beader (manik-manik kaca 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik). Jumlah jaringan sareng volume metanol nyaéta sapertos kieu: sésa awak, 50 dina 1.000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT bikang, 25–50 80 µl. Endapan ieu diekstraksi metanol kadua kalayan volume metanol anu sami. Sésa sél dipiceun ku cara sentrifugasi. Metanol tina dua ékstraksi digabungkeun sareng dikeringkeun dina aliran nitrogén, teras disuspensikeun deui dina volume 80% metanol dina cai ieu: sésa awak, 50 µl; MAG sareng LRT bikang, 30 µl.
Sampel dianalisis dina spéktrométer massa (ID-X, Thermo Fisher) anu digandengkeun kana instrumen LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl sampel diinjeksikeun kana kolom 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) anu dijaga dina suhu 25 °C. Fase gerak pikeun LC nyaéta A (cai, 0,1% asam format) sareng B (asetonitril, 0,1% asam format). Gradien LC nyaéta sapertos kieu: 5% B salami 1 menit, teras ningkat janten 100% B salami 11 menit. Saatos 8 menit dina 100%, imbangan deui kolom dina 5% B salami 4 menit. Laju aliran nyaéta 0,3 ml min-1. Ionisasi dina sumber MS dilaksanakeun ku ionisasi éléktrospray anu dipanaskeun dina modeu positif sareng négatip.
Spéktrométer massa ngukur data dina rentang m/z ti 350 nepi ka 680 dina résolusi 60.000 dina modeu MS pinuh. Data MS/MS diala dina [M + H]+ (sadaya target), [M - H2O + H]+ (sadaya target), sareng [M - H]- (target anu terfosforilasi). Data MS/MS dianggo pikeun mastikeun sipat ecdysone tina target anu teu aya standar anu sayogi. Pikeun ngaidentipikasi ecdysteroid anu teu dituju, data MS/MS pikeun sadaya puncak HPLC kalayan >15% kaayaan relatif dianalisis. Kuantifikasi nganggo kurva standar anu didamel tina standar murni (20E, 3D20E) pikeun ngitung jumlah absolut atanapi pangenceran tina hiji sampel khusus (sadaya target anu sanés) pikeun ngitung ékuivalénsina kana jumlah anu aya dina hiji jalu. Pikeun 3D20E, kuantifikasi dilakukeun nganggo jumlah adduct ieu: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Data diekstrak sareng diukur nganggo Tracefinder (versi 4.1). Data MS/MS dianalisis nganggo Xcalibur (versi 4.4). Spéktra MS E, 20E sareng 3D20E dibandingkeun sareng standar masing-masing. 3D20E22P dianalisis ku derivatisasi nganggo réagen Girard. 20E22P dianalisis ku rasio m/z.
3D20E22P dimurnikeun tina MAG. Pemurnian dilaksanakeun dina skala analitik nganggo kromatografi cair ultra-kinerja (Acquity, Waters) kalayan detektor berbasis massa quadrupole (QDa, Acquity, Waters) dina kaayaan LC anu sami sareng analisis HPLC-MS/MS. Pangumpulan fraksi dipicu nalika m/z anu pakait sareng 3D20E22P dideteksi dina waktos ingetan anu sami sapertos anu ditangtukeun sateuacanna. Kamurnian sanyawa anu diekstrak teras dipariksa ku HPLC-MS/MS sapertos anu dijelaskeun di luhur.
RNA total diekstrak tina 10-12 jaringan réproduktif atanapi bagian awak anu sanés (tanpa sirah) nganggo réagen TRI (Thermo Fisher) nuturkeun pitunjuk produsén. RNA dirawat ku TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA disintésis nganggo Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) nuturkeun pitunjuk produsén. Primer pikeun PCR kuantitatif transkripsi tibalik (RT-qPCR; Tabel Data Tambahan 2) sateuacanna diterbitkeun24 atanapi dirancang nganggo Primer-BLAST26, kalayan langkung dipikaresep pikeun produk anu ukuranana 70-150 bp sareng ngawengku sambungan ékson-ékson atanapi pasangan Primer primer anu misahkeun ékson. Sampel cDNA tina tilu dugi ka opat réplika biologis diéncérkeun opat kali dina cai pikeun RT-qPCR. Kuantifikasi dilaksanakeun dina réaksi réplikasi 15 µl anu ngandung 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primer, sareng 5 µl cDNA anu diéncérkeun. Réaksi dijalankeun dina QuantStudio 6 Pro Sistem PCR real-time (Thermo Fisher) sareng data dikumpulkeun sareng dianalisis nganggo Desain sareng Analisis (versi 2.4.3). Sakumaha anu dipidangkeun dina panilitian ieu, jumlah relatif dinormalisasi kana gén ribosom RpL19 (AGAP004422), anu éksprési na henteu robih sacara signifikan sareng nyoco getih 27 atanapi kawin 3.
Kualitas RNA dipariksa nganggo Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Pustaka Illumina paired-end disiapkeun sareng dijalankeun di Broad Institute of MIT sareng Harvard. Bacaan sekuensing disaluyukeun kana génom A. gambiae (galur PEST, vérsi 4.12) nganggo HISAT2 (vérsi 2.0.5) kalayan parameter standar. Bacaan kalayan skor kualitas pemetaan (MAPQ) <30 dihapus nganggo Samtools (vérsi 1.3.1). Jumlah bacaan anu dipetakan kana gén diitung nganggo htseq-count (vérsi 0.9.1) kalayan parameter standar. Jumlah bacaan anu dinormalisasi diitung sareng éksprési gén diferensial dianalisis nganggo pakét DESeq2 (vérsi 1.28.1) dina R (vérsi 4.0.3).
Calon gén anu ngarobih ékdison diidéntifikasi ku cara milarian heula génom A. gambiae nganggo algoritma PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), nganggo nilai standar Parameter kalayan runtuyan protéin pamundut ieu: ti Bombyx mori (No. Aksesi NP_001038956.1), Musca domestica (No. Aksesi XP_005182020.1, XP_005175332.1 sareng XP_011294434.1) sareng Microplitis demolitor (No. Aksesi XP_008552646.1 sareng XP_008552645.1) EcK ti B. mori (No. Aksesi NP_001036900), Drosophila melanogaster (No. Aksesi NP_651202), Apis mellifera (No. Aksesi XP_394838) sareng Acyrthosiphon pisum (No. Aksesi XP_001947166); sareng EPP ti B. mori (No. Aksesi XP_001947166) NP_001177919.1 sareng NP_001243996.1) sareng EO ti D. melanogaster (No. Aksesi NP_572986.1) (léngkah 1). Salajengna, saringan hasil dumasar kana éksprési mRNA anu luhur (>100 fragmen/kilobase ékson per juta bacaan anu dipetakan (FPKM) atanapi >85%) dina jaringan réproduktif (LRT bikang atanapi MAG) di Gambia (léngkah 2). Pikeun ningkatkeun spésifisitas, urang milih énzim calon anu ogé diekspresikeun dina jaringan réproduktif A. albimanus, spésiés anopheles anu henteu nyintésis atanapi mindahkeun ékdison nalika kawin. Gén calon disaring dumasar kana éksprési anu handap (<100 FPKM atanapi
Bikang parawan umur 4-6 dinten anu ditandaan ku 15N kapaksa kawin sareng jalu parawan anu teu ditandaan anu sami umurna. Kawin anu suksés diverifikasi ku cara ngadeteksi colokan kawin dina mikroskop epifluoresensi. Dina 3, 12, sareng 24 hpm, atrium 45-55 bikang anu kawin dibedah kana 50 µl buffer amonium bikarbonat (pH 7.8) sareng dihomogenisasi nganggo alu. Homogenat disentrifugasi sareng supernatan dicampur sareng 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) dina 50 mM amonium bikarbonat. Supernatan sareng pelet tina unggal sampel dibekukeun dina és garing sareng dikirim sapeuting ka laboratorium MacCoss di Universitas Washington, dimana persiapan sampel pikeun LC-MS / MS réngsé. Suspensikeun deui pelet dina 50 µl 0,1% RapiGest dina 50 mM amonium bikarbonat sareng sonikasi dina cai mandi. Konsentrasi protéin pelet sareng supernatan diukur ku uji BCA, sampel dikirangan ku 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), dialkilasi ku 15 mM iodoacetamide (Sigma) sareng diinkubasi dina suhu 37 °C (1:0 50) salami 1 jam kalayan tripsinisasi: rasio tripsin:substrat). RapiGest dilisis ku panambahan 200 mM HCl, dituturkeun ku inkubasi dina suhu 37 °C salami 45 menit sareng sentrifugasi dina 14.000 rpm salami 10 menit dina suhu 4 °C pikeun miceun lebu. Sampel dikumbah ku ékstraksi fase padet modeu ganda (kartrij Oasis MCX, Waters) sareng disuspensikeun deui dina asam format 0,1% pikeun konsentrasi protéin ahir 0,33 µg µl-1. Protéom MAG anu teu dilabélan dianalisis sacara sami ti jalu prawan. Dua réplika analitis dianalisis pikeun masing-masing Sampelna. Salajengna, 1 µg masing-masing dianalisis nganggo kolom silika leburan 25 cm 75 μm kalayan bubu frit Kasil1 (PQ) silika leburan 4 cm anu dipak ku résin fase terbalik Jupiter C12 (Phenomenex) sareng kromatografi cair 180 menit. Intisari sampel – MS/MS dijalankeun dina spéktrométer massa Q-Exactive HF (Thermo Fisher) kalayan Sistem nanoACQUITY UPLC (Waters). Data akuisisi anu aya hubunganana sareng data anu dihasilkeun pikeun unggal palaksanaan dirobih kana format mzML nganggo Proteowizard (versi 3.0.20287) sareng nganggo Comet31 (versi 3.2) ngalawan database FASTA anu ngandung runtuyan protéin tina Anopheles gambiae (VectorBase versi 54), Anopheles coluzzi. Panéangan dilakukeun dina Mali-NIH (VectorBase versi 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maret 2021), A. gambiae RNA-seq, sareng terjemahan tilu pigura tina kontaminan manusa anu dipikanyaho. FDR anu cocog sareng peta péptida ditangtukeun nganggo Percolator32 (versi 3.05) kalayan ambang 0,01, sareng péptida dirakit kana idéntifikasi protéin nganggo parsimony protéin dina Limelight33 (versi 2.2.0). Kaayaan protéin relatif diperkirakeun nganggo faktor kaayaan spéktral normalized (NSAF) anu diitung pikeun unggal protéin dina unggal prosés sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna. NSAF relatif ka unggal protéin dirata-ratakeun dina sampel tina dua réplikasi biologis anu béda. 15N labél hasil nutupan protéom bikang, sanaos sajumlah alit protéin anu teu dilabélan tiasa dideteksi tina parawan anu dilabélan. Kami ngarékam deteksi réduksi protéin jalu (1-5 spéktrum) dina sampel atah bikang ngan ukur dina prosés téknis, dimana sampel atah dijalankeun saatos sampel jalu/kawin, salaku hasil tina HPLC "dibawa". Protéin anu kadang-kadang kapanggih salaku 'kontaminan' tina parawan anu dilabélan didaptarkeun dina Tabel Tambahan 1.
Dua péptida antigénik, QTTDRVAPAPDQQQ (dina isotipe PA) sareng MESDGTTPSGDSEQ (dina isotipe PA sareng PB) dina Genscript. Dua péptida digabungkeun, teras dikonjugasi kana protéin pamawa KLH sareng disuntikkeun kana kelenci Selandia Anyar. Kelenci-kelenci éta dikorbankeun saatos suntikan kaopat, sareng total IgG diisolasi ku purifikasi afinitas. IgG tina kelenci anu paling spésifik EPP dianggo pikeun western blotting salajengna.
Pikeun western blots, MAG (n = 10, dimana n ngagambarkeun jumlah sampel reungit anu mandiri sacara biologis) sareng LRT bikang (n = 30) ti jalu parawan umur 4 dinten sareng bikang parawan atanapi anu dikawinkeun sacara paksa (<10 pasca-kawin), Buffer ékstraksi protéin (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natrium deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × koktail inhibitor protéase (Roche)) ditambahkeun sacara misah. Sampel dihomogenisasi langsung saatos dibedah nganggo beader (manik-manik kaca 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik). Lebu anu teu leyur dipiceun ku cara sentrifugasi dina 20.000 g dina suhu 4 °C. Protéin diukur ku uji Bradford (Bio-Rad). Teras, 20 µg protéin MAG, 40 µg protéin LRT, sareng 20 µg protéin bulk sésa dicandak. didenaturasi sareng dipisahkeun ku 10% Bis-Tris NuPAGE nganggo buffer MOPS. Protéin dipindahkeun ka mémbran polivinilidena fluorida nganggo sistem transfer iBlot2 (Thermo Fisher). Mémbran dikumbah dua kali dina 1 × PBS-T (0,1% Tween-20 dina PBS) teras diblokir dina buffer pameungpeuk Odyssey (Li-Cor) salami 1 jam dina suhu 22°C. Mémbran dikocok sapeuting dina suhu 4°C nganggo antibodi primér poliklonal anti-EPP kelenci khusus (1:700 dina buffer pameungpeuk) sareng antibodi primér monoklonal anti-aktin beurit MAC237 (Abeam; 1:4.000). Mémbran dikumbah nganggo PBS-T teras diinkubasi sareng antibodi sekundér (anti-kelinci 800CW kalde sareng anti-tikus embe 680LT (Li-Cor), duanana 1:20.000) dina buffer pameungpeuk anu ngandung 0,01% SDS sareng 0,2% Tween -20 salami 1 jam dina suhu 22 °C. Mémbran dikumbah ku PBS-T sareng dicitrakeun ku pamindai Odyssey CLx. Gambar dikumpulkeun sareng diolah dina Image Studio (versi 5.2). Pita khusus anu pakait sareng isoform EPP-RA (82 kDa) teu acan kadeteksi.
Daérah pangkodean EPP (salaku isoform AGAP002463-RB anu ngandung domain histidin fosfatase, panéangan domain lestari NCBI 34) sareng EcK2 (AGAP002181) diklon kana plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Primer didaptarkeun dina Tabel Data Tambahan 2. Dalapan pangiket GS4 (sasarengan) dipasang sateuacan tag 6xHis C-terminal tina konstruksi pET-21a(+)-EcK2. Protéin rekombinan dihasilkeun nganggo réaksi sintésis protéin E. coli bébas sél NEBExpress (New England BioLabs). Protéin rekombinan dimurnikeun nganggo kolom spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). Protéin kontrol dihidrofolat réduktase (DHFR) dihasilkeun nganggo citakan DNA tina Kit Sintésis Protéin E. coli Bébas Sélu NEBExpress. Protéin disimpen dina 50% gliserol dina PBS dina suhu -20 °C dugi ka 3 bulan.
Aktivitas fosfatase tina EPP sareng ekstrak jaringan diukur nganggo 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Buffer réaksi ngandung 25 mM Tris, 50 mM asam asetat, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, sareng 1 mM DTT. Jaringan dihomogenisasi dina buffer réaksi sareng sésa sél dipiceun ku cara sentrifugasi. Mimitian réaksi ku cara nambihan énzim atanapi ekstrak jaringan kana buffer réaksi anu ngandung 2,5 mg ml-1 pNPP. Campuran réaksi diinkubasi dina suhu kamar dina poék, sareng jumlah pNP anu dikonvérsi tina pNPP diukur ku cara ngukur absorbansi dina 405 nm dina sababaraha waktos.
Pikeun aktivitas EcK in vitro, protéinna diinkubasi ku 0,2 mg 20E atanapi 3D20E dina 200 µl buffer (pH 7,5) anu ngandung 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP sareng 10 mM MgCl2 salami 2 jam dina suhu 27 °C. Réaksina dieureunkeun ku nambihan 800 µl metanol, teras didinginkan dina -20 °C salami 1 jam, teras disentrifugasi dina 20.000 g salami 10 menit dina suhu 4 °C. Supernatan teras dianalisis ku HPLC-MS/MS. Pikeun nganonaktipkeun protéin anu dianggo dina grup kontrol, protéinna diinkubasi dina 50% gliserol dina PBS salami 20 menit dina suhu 95 °C.
Pikeun aktivitas EPP in vitro, protéinna diinkubasi sareng 3D20E22P (sarua jeung jumlah anu aya dina 18 pasang MAG, anu dimurnikeun ku HPLC-MS/MS) dina 100 µl buffer (pH 7.5) anu ngandung 25 mM Tris, 50 mM asam asetat, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, sareng 1 mM DTT salami 3 jam dina suhu 27 °C. Réaksina dieureunkeun ku cara nambahkeun 400 µl metanol sareng didinginkan dina -20 °C salami 1 jam, teras disentrifugasi dina 20.000 g salami 10 menit dina suhu 4 °C. Supernatan dianalisis ku HPLC-MS/MS.
Fragmen PCR pikeun EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) sareng EcK2 (556 bp) diamplifikasi tina cDNA anu disiapkeun tina mayit reungit tanpa sirah campuran jenis kelamin. Fragmen PCR tina kontrol eGFP (495 bp) diamplifikasi tina pCR2.1-eGFP anu parantos dijelaskeun sateuacanna; Primer PCR didaptarkeun dina Tabel Data Tambahan 2. Fragmen PCR diselapkeun di antara promotor T7 anu dibalikkeun dina plasmid pL4440. Konstruk plasmid dicandak tina E. coli kompeten NEB 5-α (New England Biolabs) sareng diverifikasi ku sekuensing DNA sateuacan dianggo (tingali Data Tambahan 1 pikeun sekuen sisipan). Primer anu cocog sareng promotor T7 (Tabel Data Tambahan 2) dianggo pikeun ngamplipikasi sisipan tina plasmid berbasis pL4440. Ukuran produk PCR dikonfirmasi ku éléktroforésis gél agarosa. RNA ds ditranskripsi tina témplat PCR nganggo Kit Transkripsi Megascript T7 (Thermo Fisher) sareng dimurnikeun numutkeun pitunjuk produsén kalayan modifikasi anu dijelaskeun sateuacanna.
Pikeun injeksi dsRNA, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) disuntikkeun dina konsentrasi 10 ng nl-1 kana toraks jalu atanapi bikang déwasa (Nanoject III, Drummond) dina 1 dinten saatos éklosi. Tingkat knockdown gén ditangtukeun sahenteuna dina tilu réplikasi biologis ku ékstraksi RNA, sintésis cDNA, sareng RT-qPCR. Pikeun injeksi ecdysone, bikang parawan umur 4 dinten atanapi parawan umur 6 dinten anu dibéré getih disuntikkeun ku 0,13, 0,21, atanapi 0,63 µg 20E atanapi 3D20E (Nanoject III, Drummond) dina konsentrasi 1,3, 2,1, masing-masing, gumantung kana desain ékspérimén atanapi 6,3 ng nl-1. Inject 100 nl 10% (vol/vol) étanol dina cai; 100 nl 3D20E22P dina 10% étanol (sarua jeung 75% tina jumlah anu aya dina sapasang MAG). Reungit sacara acak ditugaskeun ka grup suntikan.
Pikeun uji pemijahan, reungit bikang umur 3 dinten dibéré getih manusa sacara ad libitum. Cabut reungit anu dibéré dahareun sawaréh atanapi anu henteu dibéré dahareun. Gumantung kana perlakuanna, reungit bikang ditempatkeun dina cangkir pemijahan anu misah salami opat wengi sahenteuna 48 jam saatos tuang getih. Endog diitung dina stéréoskop (Stemi 508, Zeiss); pikeun bikang anu kawin, endog anu megar jadi larva dianggap subur.
Pikeun uji coba kawin, bikang diidinan sahenteuna 2 dinten gumantung kana perlakuan pikeun ngembangkeun résistansi kana kawin, sareng jalu anu cocog sareng umur tipe liar salajengna diwanohkeun kana kandang anu sami. Dua wengi saatosna, vesikel bikang anu dibuahan dibedah sareng DNA génomik dileupaskeun ku cara freeze-thaw sareng sonikasi dina buffer anu ngandung 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, sareng 25 mM NaCl (pH 8.2). Sampel diinkubasi ku Proteinase K (0.86 µg µl-1) salami 15 menit dina suhu 55 °C, dituturkeun ku 10 menit dina suhu 95 °C. Preparat DNA génomik kasar diéncérkeun 10 kali lipat sareng dideteksi qPCR tina runtuyan kromosom Y; primer didaptarkeun dina Tabel Data Tambahan 2. Henteuna runtuyan kromosom Y nunjukkeun teu aya kawin.
Pikeun uji kawin ulang, bikang anu dipaksa kawin dipariksa pikeun ayana colokan kawin pikeun mastikeun status kawin sareng ngantepkeun 2 dinten pikeun ngembangkeun réfraktoriness kawin nalika teu aya jalu, sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna 36. Jalu anu mawa spérma transgenik DsRed teras diasupkeun kana kandang bikang. Dua wengi saatosna, vesikel anu ngabuahan dibedah tina bikang, sareng DNA génomik disiapkeun sapertos anu dijelaskeun di luhur sareng dideteksi qPCR tina transgen DsRed; primer didaptarkeun dina Tabel Data Tambahan 2. Henteuna transgen DsRed nunjukkeun yén teu aya kawin ulang anu kajantenan.
3D20E disintésis sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna 37. Sacara singget, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) dilarutkeun dina 10 ml cai, dituturkeun ku panambahan 30 mg platinum hideung (dina bentuk bubuk, Sigma-Aldrich). Aliran O2 anu lemes terus-terusan digelembungkeun kana campuran réaksi, anu diaduk dina suhu kamar. Saatos 6 jam, 30 mL metanol ditambahkeun pikeun ngeureunkeun réaksi. Campuran éta disentrifugasi pikeun miceun partikel katalis. Supernatan diuapkeun dugi ka garing dina vakum dina suhu kamar. Produk réaksi anu garing dilarutkeun dina 10% étanol sareng metanol pikeun injeksi pikeun analisis HPLC-MS/MS. Laju konvérsi (ti 20E ka 3D20E) sakitar 97% (Gambar 4b), sareng spéktrum MS tina 3D20E anu disintésis cocog sareng anu aya dina bikang anu dikawinkeun (Gambar 4c).
Legenda ngandung detil spésifik tina tés statistik anu dilaksanakeun. GraphPad (versi 9.0) dianggo pikeun ngalaksanakeun tés pasti Fisher, tés Mantel-Cox, sareng tés-t Student. Tés Cochran-Mantel-Haenszel dilaksanakeun nganggo skrip R khusus (sayogi di https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Sebaran data diuji normalitas nganggo tés Shapiro-Wilk kalayan ambang signifikansi 0,05. Nalika data gagal dina tés normalitas, tés Mann-Whitney dilaksanakeun. Data survival dianalisis nganggo tés Mantel-Cox. Pakét DESeq2 (versi 1.28.1) dianggo pikeun ngalaksanakeun analisis éksprési diferensial tingkat gén RNA-seq. Bilah horizontal dina grafik ngagambarkeun median. Nilai signifikansi P = 0,05 dianggo salaku ambang pikeun sadaya tés.
Kanggo inpormasi lengkep ngeunaan desain panilitian, tingali abstrak Laporan Panilitian Alam anu numbu ka artikel ieu.
Data protéomik MS disimpen kana Konsorsium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ngalangkungan PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) nganggo idéntifikasi sét data PXD032157.
Set data RNA-seq disimpen dina Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) dina rékaman serial GSE198665.
Kumpulan data tambahan anu dihasilkeun sareng/atanapi dianalisis salami panilitian ayeuna tiasa diala ti panulis anu saluyu upami aya pamundut anu wajar. Artikel ieu nyayogikeun data sumber.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroid séks serangga anu teu dipaliré? Jalu: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone sareng kamekaran ovarium dina Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).
Waktos posting: 08-Jul-2022