Pamilahan protéin dina jalur sékrési penting pisan pikeun ngajaga kompartementalisasi sél sareng homeostasis. Salian ti pamilahan anu dimediasi cangkang, peran lipid dina pamilahan kinesin dina prosés transportasi sékrési mangrupikeun patarosan dasar anu lami anu tacan dijawab. Di dieu, urang ngalaksanakeun pencitraan real-time multiwarna résolusi tinggi 3D sacara simultan pikeun ngabuktikeun in vivo yén protéin glikosilfosfatidilinositol anu nembé disintésis kalayan gugus lipid seramida anu panjang pisan dikelompokkeun sareng diklasifikasikeun kana endoplasma khusus. Situs kaluar bersih, anu béda ti anu dianggo ku protéin transmembran. Salaku tambahan, urang nunjukkeun yén panjang ranté seramida dina mémbran rétikulum éndoplasma penting pisan pikeun selektivitas pamilahan ieu. Panilitian kami nyayogikeun bukti in vivo langsung anu munggaran pikeun ngaklasifikasikeun kargo protéin dumasar kana panjang ranté lipid kana situs ékspor selektif dina jalur sékrési.
Dina sél eukariotik, protéin anu disintésis dina retikulum endoplasma (ER) teras disortir nalika diangkut ngalangkungan jalur sékrési pikeun dikirimkeun ka tujuan sél anu pas (1). Salian ti sorting anu dimediasi ku lapisan, parantos lami dispekulasikeun yén lipid-lipid tertentu ogé tiasa janten titik kaluar selektif ku cara ngagolongkeunana kana domain mémbran spésifik anu protéin spésifik (2-5). Nanging, masih kurangna bukti langsung in vivo pikeun ngabuktikeun mékanisme anu mungkin dumasar kana lipid ieu. Pikeun ngarengsekeun masalah dasar ieu, urang nalungtik dina ragi kumaha protéin jangkar glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) diékspor sacara béda ti ER. GPI-AP mangrupikeun rupa-rupa protéin permukaan sél anu nyambung ka lipid (6, 7). GPI-AP mangrupikeun protéin anu disekresikeun anu napel kana leaflet luar mémbran plasma ngalangkungan bagian glikolipid (jangkar GPI). Aranjeunna nampi jangkar GPI salaku modifikasi pasca-translasi konservatif dina lumen ER (8). Saatos napel, GPI-AP ngaliwat aparatus Golgi (5, 9) ti ER ka mémbran plasma. Ayana jangkar GPI nyababkeun GPI-AP diangkut misah ti protéin anu disekresikeun transmembran (kalebet protéin mémbran plasma anu sanés) sapanjang jalur sékrési (5, 9, 10). Dina sél ragi, GPI-AP dipisahkeun tina protéin anu disekresikeun anu sanés dina retikulum endoplasma, teras dibungkus kana vesikel unik anu dibungkus ku kompleks protéin lapisan II (COPII) (6, 7). Faktor anu nangtukeun prosés klasifikasi ieu dina prosés ékspor ER teu jelas, tapi aya spékulasi yén mékanisme ieu panginten meryogikeun lipid, khususna remodeling struktural bagian lipid tina jangkar GPI (5, 8). Dina ragi, remodeling lipid GPI dimimitian langsung saatos GPI napel, sareng dina seueur kasus, éta nyababkeun seramida ngabeungkeut kana asam lemak jenuh ranté panjang 26-karbon (C26:0) (11, 12). Seramida C26 nyaéta seramida utama anu dihasilkeun ku sél ragi dugi ka ayeuna. Ieu disintésis dina ER sareng kaseueuran diékspor ka aparatus Golgi ngalangkungan vesikel COPII (13). Ékspor ER GPI-AP sacara khusus meryogikeun sintésis seramida anu terus-terusan (14, 15), sareng kahareupna, konvérsi seramida ka seramida inositol fosfat (IPC) dina aparatus Golgi gumantung kana sintésis jangkar GPI (16). Panilitian biofisik nganggo mémbran jieunan nunjukkeun yén seramida ranté asil anu panjang pisan tiasa ngahiji pikeun ngabentuk domain anu teratur kalayan sipat fisik anu unik (17, 18). Data ieu ngarah kana hipotesis yén seramida C26 sareng GPI-AP sareng seramida C26 nganggo sipat fisikna pikeun ngahiji kana daérah atanapi daérah anu teratur dina lingkungan lipid mémbran ER anu relatif pabalatak. Ieu utamina diwangun ku gliserolipid pondok sareng teu jenuh (C16:1 sareng C18:1) (19, 20). Daérah-daérah ieu bakal sacara selektif difokuskeun kana situs kaluar ER (ERES) anu khusus, dimana seramida sareng GPI-AP anu didasarkeun kana seramida tiasa diangkut babarengan ka Golgi dina vesikel COPII khusus anu sami (5).
Dina ieu panilitian, urang parantos nguji langsung mékanisme dumasar lipid ieu ku ngagunakeun mikroskop pencitraan real-time confocal super-resolution (SCLIM), nyaéta téknik mikroskop canggih anu tiasa niténan protéin anu dilabélan fluoresensi sacara simultan. Gambar tilu warna sareng tilu diménsi (3D) gaduh résolusi sareng kecepatan anu luhur pisan dina sél hirup (21, 22).
Mimitina urang nerapkeun téknologi SCLIM pikeun ngajelaskeun kumaha GPI-AP normal kalayan gugus ceramide C26 disaring tina protéin anu dikaluarkeun ku transmembran saatos ninggalkeun ER dina S. cerevisiae. Pikeun mariksa klasifikasi ER, urang nganggo sistem genetik anu tiasa langsung ngabayangkeun kargo anu nembé disintésis asup ka ERES in vivo (7, 23). Salaku kargo, urang milih GPI-AP Gas1 dumasar ceramide C26 anu dilabélan ku protéin fluoresensi héjo (GFP) sareng protéin anu dikaluarkeun ku transmembran Mid2 dilabélan ku protéin fluoresensi infrabeureum caket (iRFP), duanana narékahan mémbran plasma (24–26). Dina mutan sénsitip suhu sec31-1, dua kargo ieu diekspresikeun dina promotor anu tiasa diinduksi galaktosa sareng pananda ERES konstitutif. Dina suhu ekstrim (37°C), kusabab mutasi sec31-1 mangaruhan fungsi komponén lapisan COPII Sec31 pikeun ngahalangan pengecambahan COPII sareng ékspor ER, kargo anu nembé disintésis akumulasi di ER (23). Saatos niiskeun kana suhu anu handap (24°C), sél mutan sec31-1 pulih tina daérah sékrési, sareng akumulasi kargo sintétik énggal mimiti diékspor ti UGD. Visualisasi CLIM nunjukkeun yén kalolobaan Gas1-GFP sareng Mid2-iRFP anu nembé disintésis masih akumulasi dina UGD sél mutan sec31-1 saatos inkubasi dina suhu 37°C teras dileupaskeun dina suhu 24°C salami 5 menit (Gambar 1). Kusabab Mid2-iRFP disebarkeun dina sakumna mémbran UGD, sareng Gas1-GFP dikonsentrasikeun sareng dikumpulkeun dina daérah mémbran UGD anu teu kontinyu, distribusina béda pisan (Gambar 1, A dugi ka C sareng Pilem S1). Salaku tambahan, sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 1D, gugusan Gas1-GFP henteu gaduh Mid2-iRFP. Hasil ieu nunjukkeun yén GPI-AP sareng protéin transmembran dipisahkeun kana daérah mémbran UGD anu béda ti mimiti. Gugus Gas1-GFP aya di gigireun ERES husus anu dilabélan ku protéin mantel COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E sareng F, sareng pilem S1) (23).
Sél sec31-1 ngébréhkeun sékrési anu diinduksi ku galaktosa, seramida ranté asil panjang (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, héjo) sareng protéin transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) sareng labél ERES Konstruktif Sec13-mCherry (ERES, magenta) ieu diinkubasi dina suhu 37°C salami 30 menit, dipindahkeun ka 24°C, sareng dicitra ku SCLIM 5 menit saatosna. (A dugi ka C) nunjukkeun gambar 2D gabungan atanapi tunggal anu representatif tina bidang (A), gambar proyéksi 2D tina 10 bagian-z (B) atanapi gambar belahan sél 3D tina kargo sareng spidol ERES (C). Bilah skala 1μm (A sareng B). Unit skala nyaéta 0,551μm (C). Gas1-GFP dideteksi di daérah atanapi klaster ER anu diskrit, sedengkeun Mid2-iRFP dideteksi sareng disebarkeun di sakumna mémbran ER (C). (D) Grafik nunjukkeun inténsitas fluoresensi relatif Gas1-GFP sareng Mid2-iRFP dina gugusan Gas1-GFP sapanjang garis panah bodas (kénca). AU, unit acak. (E sareng F) ngagambarkeun gambar 3D anu ngagabungkeun barang sareng tanda ERES. Gugusan Gas1-GFP dideteksi caket ERES khusus. Unit skala nyaéta 0,551μm. (F) Panah padet bodas nandakeun gugusan Gas1-GFP anu aya hubunganana sareng ERES. Panel tengah sareng katuhu nunjukkeun gambar 3D anu digedekeun sareng tampilan anu diputer tina gugusan Gas1-GFP anu dipilih.
Hubungan spasial anu raket antara klaster Gas1-GFP sareng ERES khusus nunjukkeun yén Gas1-GFP tiasa lebet kana ERES selektif, anu béda ti selektivitas anu dianggo ku Mid2-iRFP pikeun ninggalkeun ER. Pikeun ngungkulan kamungkinan ieu, kami ngitung rasio ERES ngan ukur pikeun hiji atanapi dua barang (Gambar 2, A dugi ka C). Kami mendakan yén kalolobaan ERES (70%) ngan ukur ngandung hiji jinis kargo. Gambar handap Gambar 2C nunjukkeun dua conto khas ERES kalayan ngan ukur Gas1-GFP (Gambar 1) atanapi ngan ukur Mid2-iRFP (Gambar 2). Sabalikna, sakitar 20% ERES ngandung dua kargo anu tumpang tindih di daérah anu sami. Kapanggih yén sababaraha ERES (10%) ngandung dua jinis kargo, tapi éta diisolasi di daérah anu béda pisan. Ku alatan éta, analisis statistik ieu nunjukkeun yén saatos ER diékspor, GPI-AP Gas1-GFP sareng kargo transmembran Mid2-iRFP dibagi kana ERES anu béda (Gambar 2D). Efisiensi pamilahan ieu saluyu pisan sareng analisis biokimia sateuacanna (6) sareng panangtuan morfologis (7). Urang ogé tiasa niténan paripolah kargo anu dikarantina anu lebet ka ERES (Gambar 2E sareng Pilem S2). Gambar 2E nunjukkeun yén ngan ukur sabagian alit Gas1-GFP (panel 3) atanapi Mid2-iRFP (panel 4) anu lebet ka ERES ti hiji sisi sareng diwatesan di daérah anu diskrit. Panel 5 tina Gambar 2E nunjukkeun yén Gas1-GFP sareng Mid2-iRFP kadang-kadang kapendak dina ERES anu sami, tapi aranjeunna lebet ti sisi anu béda sareng dikonsentrasikeun di daérah anu misah anu tiasa ngawakilan vesikel COPII anu béda. Kami ogé mastikeun yén pamisahan sareng klasifikasi Gas1 GPI-AP dumasar seramida C26 salaku ERES selektif anu dititénan spésifik sabab kargo sékrési transmembran anu sanés, protéin mémbran plasma anu ditandaan GFP Axl2 (27), nunjukkeun paripolah anu sami sareng Mid2-iRFP. (Gambar S1 sareng Pilem S3). Axl2-GFP anu nembé disintésis disebarkeun ngaliwatan mémbran ER sapertos Mid2-iRFP (Gambar S1, A sareng B), sareng dilokalisasi babarengan sareng Mid2-iRFP dina kaseueuran ERES (Gambar S1, B dugi ka D). Panel 1 sareng 2 tina Gambar 1. S1C nunjukkeun dua conto has ERES dimana dua kargo transmembran tumpang tindih. Dina kasus ieu, duanana barang asup ka ERES babarengan (Gambar S1E, Panel 3 sareng Pilem S3).
Sél sec31-1 anu ngébréhkeun sékrési anu tiasa diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, héjo) sareng Mid2-iRFP (TMP, biru) sareng labél ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) disimpen dina suhu 37°C. Saatos diinkubasi salami 30 menit dina suhu °C, pindahkeun ka 24°C pikeun ngaleupaskeun blok sékrési, sareng gambar nganggo SCLIM saatos 20 menit. (A dugi ka C) Gambar proyéksi 2D répréséntatif (A; bilah skala, 1μm) atanapi gambar belahan sél 3D (B sareng C; unit skala, 0,456μm) tina kargo sareng 10 bagian-z anu ditandaan ku ERES. Panel handap dina (B) sareng panel dina (C) nampilkeun gambar anu diprosés pikeun ngan ukur nampilkeun barang anu aya dina ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) sareng Mid2-iRFP (biru ngora)]. (C) Panah kabuka: ERES ngan ukur mawa hiji kargo (1 dugi ka 4). Panah kulawu: ERES ngandung kargo anu dipisahkeun (5). Panah bodas padet: ERES ngandung kargo anu aya di lokasi anu sami. Di handap: ERES tunggal anu dipilih ngan ukur ngandung Gas1-GFP (1) atanapi Mid2-iRFP (2). Bilah skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf anu dijelaskeun dina (C). Persentase rata-rata ERES anu ngan ukur ngandung hiji kargo (Gas1-GFP atanapi Mid2-iRFP), kargo anu dipisahkeun sareng kargo anu tumpang tindih. Dina tilu ékspérimén mandiri, n=432 dina 54 sél. Bilah kasalahan = SD. Uji t dua sisi anu teu dipasangkeun. *** P = 0,0002. (E) Gambar 3D tina ERES anu dipilih tina kargo karantina ditandaan ku (C). Gas1-GFP (héjo) (3) atanapi Mid2-iRFP (biru) (4) asup ka ERES (magenta) ti hiji sisi sareng diwatesan ka daérah alit dina ERES. Kadang-kadang, dua jinis kargo asup ka ERES anu sami (5) ti sisi anu sami sareng diwatesan di daérah anu terasing di jero ERES. Skala bar, 100 nm.
Salajengna, urang nguji hipotesis yén seramida ranté asil panjang (C26) anu aya dina mémbran ER ngadorong klasterisasi sareng panyortiran khusus Gas1 kana ERES selektif. Pikeun tujuan ieu, urang nganggo galur ragi anu dimodifikasi GhLag1, dimana dua sintase seramida endogén Lag1 sareng Lac1 diganti ku GhLag1 (homolog kapas Lag1), ngahasilkeun galur ragi kalayan galur Ceramide mémbran sél anu langkung pondok tibatan tipe liar (Gambar 3A) (28). Analisis spéktrométri massa (MS) nunjukkeun yén dina galur tipe liar, 95% tina total seramida nyaéta seramida ranté anu panjang pisan (C26), sedengkeun dina GhLag1, 85% seramida panjang pisan (C18 sareng C16). ), ngan ukur 2% seramida nyaéta seramida ranté anu panjang pisan (C26). Sanaos seramida C18 sareng C16 mangrupikeun seramida utama anu dideteksi dina mémbran GhLag1 dugi ka ayeuna, analisis MS ogé mastikeun yén jangkar GPI Gas1-GFP anu diekspresikeun dina galur GhLag1 ngandung seramida C26, anu sami sareng lipid tipe liar. Kualitasna sami (Gambar 3A) (26). Ku alatan éta, ieu hartosna yén énzim remodeling seramida Cwh43 selektif pisan pikeun seramida C26, sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 26, éta langkung milih ngagabungkeun jangkar GPI tina sajumlah alit seramida C26 dina galur GhLag1. S2 (29). Nanging, mémbran sél GhLag1 dasarna ngan ukur ngandung seramida C18-C16, sedengkeun Gas1-GFP masih gaduh seramida C26. Kanyataan ieu ngajantenkeun galur ieu alat anu idéal pikeun sacara khusus ngarengsekeun masalah panjang ranté asil seramida mémbran dina ER. Peran hipotétis kelas sareng pamilahan. Teras, urang mimiti nalungtik kamampuan C26 Gas1-GFP pikeun akumulasi dina klaster dina GhLag1 kalayan alel mutan sénsitip suhu sec31-1 ngalangkungan mikroskop fluoresensi konvensional, dimana ngan ukur ranté panjang (C18-C16) anu aya dina mémbran ER Ceramide (Gambar 3). Urang niténan yén dina sec31-1, kaseueuran Gas1-GFP dikonsentrasikeun dina klaster, sedengkeun Gas1-GFP dina sec31-1 GhLag1 kalayan mémbran ER ceramide panjang (C18-C16) utamina henteu dikelompokkeun sareng disebarkeun dina sakumna mémbran ER. Pikeun langkung tepatna, kusabab klaster dumasar ceramide C26 raket patalina sareng ERES khusus (Gambar 1), urang salajengna nalungtik naha prosés ieu ogé tiasa ngalibatkeun fungsi mékanisme protéin ékspor ER. GPI-AP nganggo sistem COPII khusus pikeun ékspor ER, anu sacara aktif diatur ku remodeling struktural Ted1 tina bagian glikan tina jangkar GPI (30, 31). GPI-glycan rekombinan teras dikenal ku kompleks reséptor kargo transmembran p24, anu antukna sacara selektif ngarékrut Lst1, nyaéta isoform spésifik tina subunit pangiket kargo COPII utama Sec24, ngabentuk Vésikel COPII anu beunghar GPI-AP diperyogikeun (31-33). Ku alatan éta, urang ngawangun mutan ganda anu ngagabungkeun delesi protéin tunggal ieu (komponén kompleks p24 Emp24, énzim remodeling GPI-glycan Ted1 sareng subunit COPII spésifik Lst1) sareng galur mutan sec31-1, sareng nalungtik éta Naha mungkin pikeun ngabentuk Gas1-cluster GFP (Gambar 3). Urang niténan yén dina sec31-1emp24Δ sareng sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP utamina henteu dikluster sareng disebarkeun di sakumna mémbran ER, sapertos anu sateuacanna katingali dina sec31-1 GhLag1, sedengkeun dina sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Sapertos sec31-1. Hasil ieu nunjukkeun yén salian ti ayana seramida C26 dina mémbran ER, panglompokan Gas1-GFP ogé kedah ngabeungkeut kana kompleks p24, sareng henteu meryogikeun rekrutmen Lst1 khusus. Teras, urang nalungtik kamungkinan yén panjang ranté seramida dina mémbran ER tiasa ngatur beungkeutan Gas1-GFP ka p24. Nanging, urang mendakan yén ayana seramida C18-C16 dina mémbran henteu mangaruhan GPI-glikan anu diwangun deui ku kompleks p24 (Gambar S3 sareng S4, A sareng B) atanapi ngabeungkeut kana GPI-AP sareng ngékspor GPI-AP. kamampuan. Rekrut subtipe COPII Lst1 (Gambar S4C). Ku alatan éta, panglompokan anu gumantung kana seramida C26 henteu meryogikeun interaksi protéin sareng mékanisme ékspor protéin ER anu béda, tapi ngadukung mékanisme sortir alternatif anu didorong ku panjang lipid. Teras, urang nganalisis naha panjang ranté seramida asil dina mémbran ER penting pikeun klasifikasi Gas1-GFP anu efektif salaku ERES selektif. Kusabab Gas1 dina galur GhLag1 kalayan seramida ranté pondok ninggalkeun ER sareng lebet kana mémbran plasma (Gambar S5), urang yakin yén upami pamilahan didorong ku panjang ranté seramida asil, Gas1 dina galur GhLag1 tiasa dialihkeun sareng disilangkan. Barang ERES kalayan mémbran anu sami.
(A) Mémbran sél GhLag1 utamina ngandung seramida C18-C16 anu langkung pondok, sedengkeun jangkar GPI Gas1-GFP masih gaduh IPC C26 anu sami sareng sél tipe liar. Di luhur: analisis panjang ranté asil seramida dina mémbran sél galur tipe liar (Wt) sareng GhLag1p ku spéktrométri massa (MS). Data ngagambarkeun perséntase total seramida. Rata-rata tina tilu ékspérimén mandiri. Bilah kasalahan = SD. Uji t dua sisi anu teu berpasangan. **** P <0,0001. Panel handap: Analisis MS tina panjang ranté asil IPC anu aya dina jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) anu diekspresikeun dina galur tipe liar sareng GhLag1p. Data ngagambarkeun perséntase total sinyal IPC. Rata-rata tina lima ékspérimén mandiri. Bilah kasalahan = SD. Uji t dua sisi anu teu berpasangan. ns, teu penting. P = 0,9134. (B) Mikrograf fluoresensi sél sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ sareng sec31-1lst1Δ anu ngébréhkeun Gas1-GFP anu diinduksi galaktosa diinkubasi dina suhu 37°C salami 30 menit sareng diturunkeun ka handap pikeun Ngalakukeun mikroskop fluoresensi rutin saatos 24°C. Panah bodas: gugusan ER Gas1-GFP. Panah kabuka: Gas1-GFP anu teu digugus disebarkeun dina sakumna mémbran ER, nunjukkeun pewarnaan cingcin nuklir karakteristik ER. Bilah skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf anu dijelaskeun dina (B). Persentase rata-rata sél kalayan struktur Gas1-GFP punctate. Dina tilu ékspérimén mandiri, n≥300 sél. Bilah kasalahan = SD. Uji t dua sisi anu teu dipasangkeun. **** P <0.0001.
Pikeun ngarengsekeun masalah ieu sacara langsung, urang ngalaksanakeun visualisasi SCLIM tina Gas1-GFP sareng Mid2-iRFP dina GhLag1 kalayan alel mutan sénsitip suhu sec31-1 (Gambar 4 sareng Pilem S4). Saatos ER ditahan dina suhu 37°C sareng salajengna dileupaskeun dina suhu 24°C, kaseueuran Gas1-GFP anu nembé disintésis henteu dikelompokkeun sareng disebarkeun di sakumna mémbran ER, sakumaha anu dititénan ku mikroskop konvensional (Gambar 4, A sareng B). Salaku tambahan, perséntase ageung ERES (67%) kalebet dua jinis kargo anu aya di jerona (Gambar 4D). Panel 1 sareng 2 tina Gambar 4C nunjukkeun dua conto has ERES kalayan Gas1-GFP sareng Mid2-GFP anu tumpang tindih. Salaku tambahan, duanana barang direkrut kana ERES anu sami (Gambar 4E, panel 3 sareng pilem S4). Ku alatan éta, hasil urang nunjukkeun yén panjang ranté seramida asil dina mémbran ER mangrupikeun faktor penentu penting pikeun agregasi sareng klasifikasi protéin ER.
Sél Sec31-1 GhLag1 anu ngébréhkeun sékrési anu diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, héjo) sareng Mid2-iRFP (TMP, biru) sareng Sec13-mCherry anu dilabélan ERES konstitutif (ERES, magenta) Inkubasi dina suhu 37°C. Teraskeun salami 30 menit, lungsur ka 24°C pikeun ngaleupaskeun sékrési, teras gambar nganggo SCLIM saatos 20 menit. (A dugi ka C) Gambar proyéksi 2D répréséntatif (A; bilah skala, 1μm) atanapi gambar hémisfér sél 3D (B sareng C; unit skala, 0,45μm) tina 10 bagian-z anu ditandaan ku kargo sareng ERES. Panel handap dina (B) sareng panel dina (C) nampilkeun gambar anu diprosés pikeun ngan ukur nampilkeun barang anu aya dina ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) sareng Mid2-iRFP (biru ngora)]. (C) Panah anu dieusi bodas: ERES, barang tumpang tindih. Panah kabuka: ERES ngan ukur ngandung hiji barang. Panel handap: ERES anu dipilih ngagaduhan barang anu tumpang tindih (1 sareng 2) ditandaan dina (C). Bilah skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf anu dijelaskeun dina (C). Dina unit sec31-1 sareng sec31-1 GhLag1, ngan ukur hiji kargo (Gas1-GFP atanapi Mid2-iRFP) anu kalebet, sareng persentase rata-rata ERES pikeun kargo anu terasing sareng kargo anu tumpang tindih. Dina tilu ékspérimén mandiri, n = 432 dina 54 sél (sec31-1) sareng n = 430 dina 47 sél (sec31-1 GhLag1). Bilah kasalahan = SD. Uji t dua sisi anu teu dipasangkeun. *** P = 0,0002 (sec31-1) sareng ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D tina ERES anu dipilih kalayan kargo anu tumpang tindih (3) ditandaan dina (C). Gas1-GFP (héjo) sareng Mid2-iRFP (biru) ngadeukeutan ERES (magenta) ti sisi anu sami sareng tetep aya di daérah ERES anu diwatesan. Skala bar, 100 nm.
Panilitian ieu nyayogikeun bukti langsung in vivo yén kargo protéin dumasar lipid diklasifikasikeun kana situs ékspor selektif dina jalur sékrési, sareng ngungkabkeun pentingna panjang ranté asil pikeun selektivitas klasifikasi. Ngagunakeun téknik mikroskopi anu kuat sareng canggih anu disebut SCLIM, kami nunjukkeun Gas1-GFP anu nembé disintésis (mémbran plasma utama GPI-AP kalayan bagian lipid seramida ranté asil anu panjang pisan (C26) dina ragi) Daérah anu dikelompokkeun dina ER diskrit pakait sareng ERES spésifik, sedengkeun protéin anu disékrésikeun transmembran disebarkeun di sakumna mémbran ER (Gambar 1). Salaku tambahan, dua jinis barang ieu asup kana ERES anu béda sacara selektif (Gambar 2). Panjang ranté asil tina seramida sélular dina mémbran dikirangan tina C26 ka C18-C16, gugusan Gas1-GFP kaganggu kana daérah ER diskrit, sareng Gas1-GFP dialihkeun pikeun ninggalkeun ER sareng protéin transmembran ngalangkungan ERES anu sami (Gambar 3 sareng Gambar 3). 4).
Sanaos GPI-AP nganggo mékanisme protéin khusus pikeun kaluar ti ER, kami mendakan yén pamisahan anu gumantung kana seramida C26 henteu ngandelkeun interaksi protéin anu béda anu tiasa nyababkeun spésialisasi ERES (Gambar S4 sareng S5). Sabalikna, panemuan kami ngadukung mékanisme klasifikasi alternatif anu didorong ku klaster protéin dumasar lipid sareng salajengna ngaluarkeun kargo sanés. Panemuan kami nunjukkeun yén daérah atanapi klaster Gas1-GFP anu aya hubunganana sareng ERES khusus kakurangan protéin anu disekresikeun transmembran Mid2-iRFP, anu nunjukkeun yén klaster GPI-AP anu gumantung kana seramida C26 bakal ngagampangkeun asupna kana ERES anu relevan, sareng dina waktos anu sami, ngaluarkeun sékrési transmembran asup kana ERES khusus ieu (Gambar 1 sareng 2). Sabalikna, ayana seramida C18-C16 dina mémbran ER henteu nyababkeun GPI-AP ngabentuk daérah atanapi klaster, janten aranjeunna henteu ngaluarkeun atanapi ngagentos protéin anu disekresikeun transmembran kana ERES anu sami (Gambar 3 sareng 4). Ku kituna, urang ngusulkeun yén seramida C26 ngadorong pamisahan sareng klasifikasi ku cara ngagampangkeun panglompokan protéin anu numbu ka ERES khusus.
Kumaha carana ngahontal klaster anu gumantung kana seramida C26 ieu kana daérah ER anu khusus? Kacenderungan seramida mémbran pikeun misah sacara lateral tiasa nyababkeun GPI-AP sareng seramida C26 ngabentuk lipid alit sareng langsung teratur dina lingkungan lipid anu langkung henteu teratur tina mémbran ER anu ngandung gliserolipid anu langkung pondok sareng teu jenuh. Klaster kualitas (17, 18). Klaster samentawis alit ieu tiasa langkung ngahiji kana klaster anu langkung ageung sareng langkung stabil saatos ngabeungkeut kana kompleks p24 (34). Saluyu sareng ieu, kami nunjukkeun yén C26 Gas1-GFP kedah berinteraksi sareng kompleks p24 pikeun ngabentuk klaster anu langkung ageung katingali (Gambar 3). Kompleks p24 mangrupikeun oligomer hétérozigot anu diwangun ku opat protéin transmembran p24 anu béda dina ragi (35), anu nyayogikeun beungkeutan multivalén, anu tiasa nyababkeun cross-linking klaster GPI-AP alit, sahingga ngahasilkeun klaster Stabil anu langkung ageung (34). Interaksi antara ektodomain protéin GPI-AP ogé tiasa nyumbang kana agregasi na, sapertos anu dipidangkeun nalika transportasi Golgi na dina sél épitél anu terpolarisasi mamalia (36). Nanging, nalika seramida C18-C16 aya dina mémbran ER, nalika kompleks p24 ngabeungkeut Gas1-GFP, gugus anu misah anu ageung moal kabentuk. Mékanisme anu mendasari tiasa gumantung kana sipat fisik sareng kimia spésifik tina seramida ranté asil panjang. Panilitian biofisik mémbran jieunan nunjukkeun yén sanaos seramida ranté asil panjang (C24) sareng pondok (C18-C16) tiasa nyababkeun pamisahan fase, ngan ukur seramida ranté asil panjang (C24) anu tiasa ngamajukeun Kelengkungan anu luhur sareng lenturan pilem pikeun ngarobih bentuk pilem. Ngaliwatan rujukan silih (17, 37, 38). Parantos dipidangkeun yén héliks transmembran TMED2, homolog manusa Emp24, sacara selektif berinteraksi sareng sphingomyelin berbasis seramida C18 dina lobulus sitoplasma (39). Ngagunakeun simulasi dinamika molekuler (MD), urang mendakan yén duanana seramida C18 sareng C26 akumulasi di sakitar lobulus sitoplasma tina heliks transmembran Emp24, sareng aranjeunna gaduh karesep anu sami (Gambar S6). Perlu dicatet yén ieu nunjukkeun yén heliks transmembran Emp24 tiasa nyababkeun distribusi lipid asimetris dina mémbran. Ieu mangrupikeun hasil anu nembe dumasar kana sél mamalia. Simulasi MD anu sami ogé nunjukkeun ayana lipid éter (40). Ku alatan éta, urang ngaduga yén seramida C26 dina dua lobulus ER26 diperkaya sacara lokal. Nalika GPI-AP dina lobulus luminal langsung ngabeungkeut p24 multivalén sareng akumulasi seramida C26 di sakitar p24 dina lobulus sitoplasma, éta tiasa ngamajukeun agregasi protéin sareng kelengkungan mémbran anu dihasilkeun ngalangkungan ramo (41), nyababkeun GPI-AP misah kana daérah diskrit anu caket sareng ERES, anu ogé langkung milih daérah anu melengkung pisan tina mémbran ER (42). Laporan-laporan samemehna ngadukung mékanisme anu diusulkeun (43, 44). Beungkeutan multivalén oligolektin, patogén atanapi antibodi kana glikosfingolipid (GSL) dumasar seramida dina mémbran plasma micu agregasi GSL anu ageung, ningkatkeun pamisahan fase sareng nyababkeun deformasi sareng internalisasi mémbran (44). Iwabuchi jsb. (43) Kapanggih yén dina ayana ranté asil anu panjang (C24) tapi sanés pondok (C16), ligan multivalén anu kabeungkeut kana laktosilseramida GSL ngainduksi formasi klaster ageung sareng invaginasi mémbran, sareng transduksi sinyal anu dimediasi Lyn sitoplasma dina leaflet diinterdigitalisasi ku ranté asil dina neutrofil anu dipasangkeun.
Dina sél épitél anu terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) kana tingkat mémbran plasma apikal ngontrol pamisahan sareng panyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi ieu didorong ku oligomerisasi GPI-AP (36), tapi éta ogé tiasa gumantung kana panjang ranté seramida anu urang mendakan dina ragi. Sanaos GPI-AP mamalia gaduh jangkar dumasar lipid éter, sareng struktur kimiana béda pisan sareng seramida ranté asil anu panjang pisan, panilitian anyar mendakan yén duanana lipid gaduh sipat fisik sareng kimia anu sami sacara évolusionér sareng fungsina (40). Ku alatan éta, bagian lipid éter dina sél mamalia tiasa sami sareng seramida C26 dina ragi, sareng peranna nyaéta pikeun ngahubungkeun sareng seramida ranté panjang dina mémbran pikeun ngamajukeun agregasi sareng panyortiran GPI-AP. Sanaos kamungkinan ieu masih kedah diuji sacara langsung, panemuan sateuacana ngadukung yén transportasi seramida ranté asil panjang ka awak Golgi henteu dilaksanakeun ku protéin transfer sitoplasmik, tapi gumantung kana sintésis jangkar GPI sapertos ragi. Ku kituna, mékanisme konservatif évolusionér sigana tiasa sacara selektif ngangkut babarengan seramida ranté asil anu panjang pisan sareng GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dina vesikel transportasi anu sami.
Dina sistem sél épitél anu terpolarisasi ragi sareng mamalia, agregasi sareng pamisahan GPI-AP tina protéin mémbran plasma anu sanés sadayana kajantenan sateuacan ngahontal permukaan sél. Paladino et al. (48) mendakan yén dina TGN sél épitél anu terpolarisasi mamalia, klaster GPI-AP henteu ngan ukur diperyogikeun pikeun klasifikasi selektif GPI-AP kana mémbran plasma apikal, tapi ogé ngatur organisasi klaster GPI-AP sareng aktivitas biologisna. Beungeut sél. Dina ragi, panilitian ieu nunjukkeun yén klaster GPI-AP anu gumantung kana seramida C26 dina ER tiasa ngatur organisasi klaster sareng aktivitas fungsional GPI-AP dina mémbran plasma (24, 49). Saluyu sareng modél ieu, sél GhLag1 alérgi kana inhibitor GPI atanapi ubar anu mangaruhan integritas témbok sél (28), sareng kabutuhan klaster Gas1-GFP fungsional (49) tina seramida ujung anu diproyeksikan dina kawin sél ragi nunjukkeun G​​​ Kamungkinan akibat fisiologis sél hLag1. Kasalahan GPI-AP. Nanging, uji coba salajengna naha organisasi fungsional permukaan sél parantos diprogram tina ER ku metode panyortir dumasar kana panjang lipid bakal janten poko panalungtikan urang ka hareup.
Galur Saccharomyces cerevisiae anu dianggo dina ieu karya didaptarkeun dina Tabel S1. Galur MMY1583 sareng MMY1635 tina SCLIM pikeun pencitraan sél hirup diwangun dina latar tukang W303. Galur ieu anu ngébréhkeun Sec13-mCherry kalayan tag protéin fluoresensi diwangun nganggo metode dumasar réaksi ranté polimérase (PCR) kalayan plasmid pFA6a salaku citakan (23). Galur anu ngébréhkeun Mid2-iRFP anu dilabélan ku protéin fluoresensi dina kadali promotor GAL1 diwangun sapertos kieu. Amplifikasi PCR tina runtuyan iRFP-KanMx tina véktor pKTiRFP-KAN (hadiah ti E. O'Shea, nomer plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; idéntifikasi sumber daya panalungtikan (RRID): Addgene_64687) Sareng diselapkeun kana C-terminus Mid2 éndogén. Saatos runtuyan génom Mid2-iRFP diamplifikasi sareng diklon kana promotor GAL1, éta diintegrasikeun kana situs Not I-Sac I tina plasmid integrasi pRS306. Plasmid anu dihasilkeun pRGS7 dilinierisasi sareng Pst I pikeun diintegrasikeun kana lokus URA3.
Gén fusi Gas1-GFP diekspresikeun dina kadali promotor GAL1 dina plasmid sentromer (CEN), anu diwangun sapertos kieu. Urutan Gas1-GFP diamplifikasi ku PCR tina plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah ti L. Popolo) sareng diklon kana situs Xma I–Xho I tina plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah ti C). Miller; Nomer plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid anu dihasilkeun dingaranan pRGS6. Gén fusi Axl2-GFP ogé diekspresikeun dina kadali promotor GAL1 tina véktor pBEVY-GL LEU2, sareng konstruksina sapertos kieu. Urutan Axl2-GFP diamplifikasi tina plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ku PCR, teras diklon kana situs Bam HI-Pst I tina vektor pBEVY-GL LEU2. Plasmid anu dihasilkeun dingaranan pRGS12. Urutan oligonukleotida anu dianggo dina panilitian ieu didaptarkeun dina Tabel S2.
Galur ieu ditambahan ku 0,2% adenin sareng 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-raffinose] ekstrak ragi beunghar protéin p (YP) medium (1% Ekstrak ragi sareng 2% protéin ept). (YPR)] atanapi 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] salaku sumber karbon, atanapi dina medium minimal sintétik (0,15% basa nitrogén ragi sareng 0,5% amonium sulfat) pikeun nambihan asam amino sareng basa anu pas anu diperyogikeun pikeun nutrisi, Sareng ngandung 2% glukosa (médium glukosa minimal sintétik) atanapi 2% galaktosa (médium galaktosa minimal sintétik) salaku sumber karbon.
Pikeun pencitraan real-time, sél mutan sec31-1 anu sénsitip kana suhu anu ngébréhkeun konstruksi dina promotor GAL1 dipelak dina média YPR dina suhu 24°C sapeuting dugi ka fase tengah log. Saatos induksi dina YPG dina suhu 24°C salami 1 jam, sél-sél éta diinkubasi dina SG dina suhu 37°C salami 30 menit, teras dipindahkeun ka 24°C pikeun dileupaskeun tina blok sékrési. Concanavalin A dianggo pikeun ngalereskeun sél dina slide kaca sareng dicitrakeun ku SCLIM. SCLIM nyaéta kombinasi tina mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 sareng lénsa minyak aperture numerik UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), pamindai confocal cakram puteran kecepatan tinggi sareng rasio sinyal-ka-noise tinggi (Yokogawa Electric), spéktrométer khusus, sareng pendinginan khusus. Intensifier gambar sistem (Hamamatsu Photonics) tiasa nyayogikeun sistem lénsa pembesar kalayan pembesaran akhir × 266.7 sareng kaméra alat gandeng muatan anu ngalikeun éléktron (Hamamatsu Photonics) (21). Akuisisi gambar dilakukeun ku parangkat lunak khusus (Yokogawa Electric). Pikeun gambar 3D, kami nganggo aktuator piezoelektrik khusus pikeun ngageterkeun lénsa obyektif sacara vertikal, sareng ngumpulkeun bagian optik 100 nm dina tumpukan. Gambar tumpukan-Z dirobih janten data voxel 3D, sareng fungsi panyebaran titik téoritis anu dianggo pikeun mikroskop confocal cakram puteran dianggo pikeun pamrosésan dekonvolusi ku parangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Ku ngagunakeun parangkat lunak Volocity pikeun sacara otomatis nangtukeun ambang batas pikeun analisis ko-lokasi, ERES kalebet kargo diukur. Analisis scan garis dilakukeun nganggo parangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Anggo perangkat lunak GraphPad Prism pikeun nangtukeun signifikansi statistik. Pikeun uji-t Student dua sisi sareng uji analisis varians hiji arah biasa (ANOVA), bédana antara kelompok dianggap gaduh dampak anu signifikan kana P <0,05 (*).
Pikeun mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sél fase log dipelak sapeuting dina YPD sareng dikumpulkeun ku cara sentrifugasi, dikumbah dua kali nganggo larutan saline buffer fosfat, teras diinkubasi dina és sahenteuna 15 menit, teras diprosés dina mikroskop sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna Pariksa (24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) anu dilengkepan ku lénsa obyektif, filter L5 (GFP), kaméra Hamamatsu sareng parangkat lunak Application Suite X (LAS X) dianggo pikeun akuisisi.
Sampel-sampelna didenaturasi ku buffer sampel SDS dina suhu 65°C salami 10 menit, teras dipisahkeun ku éléktroforésis gél SDS-poliakrilamida (PAGE). Pikeun analisis imunoblotting, 10 μl sampel dimuat per jalur. Antibodi primér: Anggo anti-Gas1 poliklonal kelenci dina pengenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelenci dina pengenceran 1:500, sareng anti-GFP poliklonal kelenci (hadiah ti H. Riezman) dina pengenceran 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal beurit dianggo dina pengenceran 1:5000 (hadiah ti J. de la Cruz). Antibodi sekundér: imunoglobulin G (IgG) anti-kelinci embe terkonjugasi peroksidase lobak (HRP) dianggo dina pengenceran 1:3000 (Pierce). IgG anti-beurit embe anu dikonjugasi ku HRP dianggo dina éncér 1:3000 (Pierce). Zona réspon imun dititénan ku metode kemiluminesensi réagen SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Sakumaha anu dijelaskeun dina (31), ékspérimén imunoprésipitasi alami dilakukeun dina fraksi ER anu diperkaya. Singkatna, kumbah sél ragi nganggo buffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride sareng campuran protease inhibitor) dina 600 nm (OD600) dina kapadetan optik 100 dua kali. Éta dipecahkeun nganggo manik-manik kaca, teras sésa sél sareng manik-manik kaca dipiceun ku cara sentrifugasi. Supernatan teras disentrifugasi dina 17.000 g salami 15 menit dina suhu 4°C. Pélét disuspensikeun deui dina TNE sareng saponin digitalis ditambahkeun kana konsentrasi ahir 1%. Suspénsi diinkubasi salami 1 jam kalayan rotasi dina suhu 4°C, teras komponén anu teu leyur dipiceun ku cara sentrifugasi dina 13.000 g dina suhu 4°C salami 60 menit. Pikeun imunoprésipitasi Gas1-GFP, mimitina inkubasi sampel nganggo manik-manik agarose kosong (ChromoTek) dina suhu 4°C salami 1 jam, teras inkubasi nganggo GFP-Trap_A (ChromoTek) dina suhu 4°C salami 3 jam. Manik-manik anu diimunoprésipitasi dikumbah lima kali nganggo TNE anu ngandung 0,2% digoxigenin, diélusi nganggo buffer sampel SDS, dipisahkeun dina SDS-PAGE, sareng dianalisis ku imunoblotting.
Sakumaha anu dijelaskeun dina (31), panangtuan cross-linking dilaksanakeun dina fraksi ER anu diperkaya. Sacara singget, fraksi ER anu diperkaya diinkubasi ku 0,5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 menit). Réaksi crosslinking dipareuman ku cara nambihan glisin (konsentrasi ahir 50 mM, 5 menit, 20°C).
Sakumaha anu parantos dijelaskeun sateuacanna (50), analisis MS tina seramida dina galur tipe liar sareng GhLag1 parantos dilaksanakeun. Singkatna, sél-sél dipelak kana fase éksponénsial (3 dugi ka 4 OD600 unit/ml) dina YPD dina suhu 30°C, sareng 25×107 sél dipanén. Métabolisme na dipareuman ku asam trikloroasetat. Anggo pangleyur ékstraksi [étanol, cai, éter, piridin sareng 4,2 N amonium hidroksida (15:15:5:1:0,018 v/v)] sareng 1,2 nmol tina standar internal seramida C17 (860517, Avanti polar lipid) kualitas). Anggo réagen monometilamina [metanol, cai, n-butanol sareng larutan metilamina (4:3:1:5 v/v)] pikeun ngalaksanakeun hidrolisis basa hampang tina ekstrak, teras anggo n-butanol jenuh cai pikeun ngadésaluran uyah. Pamungkas, ékstrak éta disuspensikeun deui dina pangleyur mode positif [kloroform/metanol/cai (2:7:1) + 5 mM amonium asetat] teras diinjeksikeun kana spéktrométer massa. Pemantauan multi-réaksi (MRM) dilaksanakeun pikeun idéntifikasi sareng kuantifikasi molekul sphingolipid. Spéktrométer massa kuadrupol tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) dilengkepan ku sumber ion nanoflow robot Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pikeun analisis lipid. Énergi tabrakan dioptimalkeun pikeun unggal kategori seramida. Data MS diala dina mode positif. Pikeun unggal réplikasi biologis, sinyal lipid nyaéta median tina tilu pangukuran mandiri.
Sakumaha anu dijelaskeun dina (31), sél (800 × 107) anu ngébréhkeun Gas1-GFP diekspresikeun ku imunoprésipitasi alami. Gas1-GFP anu dimurnikeun dipisahkeun ku SDS-PAGE sareng dipindahkeun ka mémbran polivinilidena fluorida (PVDF). Protéinna divisualisasikeun ku cara ngawarnaan PVDF ku amida hideung. Pita Gas1-GFP dipotong tina PVDF sareng dikumbah 5 kali ku metanol sareng sakali ku cai kromatografi cair-MS (LC-MS). Ku cara ngainkubasi strip mémbran ku 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer sareng 500μl campuran natrium nitrit 1 M anu nembé leyur dina suhu 37°C salami 3 jam, fraksi lipid dileupaskeun tina Gas1-GFP sareng dilisiskeun. Pelepasan inosin fosfat seramida antara glukosamin sareng inositol (51). Saatos éta, strip mémbran dikumbah opat kali nganggo cai kelas LC-MS, dikeringkeun dina suhu kamar, teras disimpen dina atmosfir nitrogén dina suhu -80°C dugi ka dianalisis. Salaku kontrol, sampel kosong mémbran PVDF dianggo pikeun unggal ékspérimén. Lipid anu diekstrak tina Gas1-GFP teras dianalisis ku MS sapertos anu dijelaskeun (50). Singkatna, strip PVDF anu ngandung GPI-lipid disuspensikeun deui dina 75μl pangleyur kapang négatif [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] sareng lulus analisis ionisasi éléktrospray (ESI)-MRM/MS spésiés sphingolipid (TSQ Vantage). Dina hal ieu, data MS diala dina mode ion négatif.
Sapertos anu parantos disebatkeun sateuacanna, bagian lipid tina jangkar GPI dipisahkeun tina GPI-AP anu dilabélan [3H]-inositol (16). Lipid dipisahkeun ku kromatografi lapisan ipis nganggo sistem pangleyur (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) sareng divisualisasikeun nganggo FLA-7000 (Fujifilm).
Sél-sél anu ngébréhkeun Gas1-GFP (600×107) dikumbah dua kali nganggo buffer TNE nganggo buffer TNE, teras dipegatkeun nganggo manik-manik kaca, teras disentrifugasi pikeun miceun sésa-sésa sél sareng manik-manik kaca. Supernatan teras disentrifugasi dina 17.000 g salami 1 jam dina suhu 4°C. Pélét dikumbah dina TNE teras diinkubasi ku 1 U PI-PLC (Invitrogen) dina TNE anu ngandung 0,2% saponin digitalis salami 1 jam dina suhu 37°C. Saatos perlakuan énzim, mémbran dipiceun ku cara sentrifugasi dina 17.000 g dina suhu 4°C salami 1 jam. Pikeun imunoprésipitat Gas1-GFP, supernatan diinkubasi ku GFP-Trap_A (ChromoTek) dina suhu 4°C sapeuting. Gas1-GFP anu dimurnikeun anu dipisahkeun ku SDS-PAGE diwarnaan ku biru brilian Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP dipotong tina kulawu anu ngurilingan akuaduk, teras saatos alkilasi nganggo iodoacetamide sareng réduksi nganggo dithiothreitol, digestion in-gel nganggo tripsin dilaksanakeun. Ékstrak sareng péptida triptik garing sareng péptida nganggo GPI-glycans. Péptida garing dilarutkeun dina 20 μl cai. Suntikkeun sabagian (8μl) kana LC. Kolom oktadesilsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diaméter jero 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Préféktur Aichi, Jepang) dianggo pikeun misahkeun péptida dina kaayaan gradién anu spésifik. Fase gerakna nyaéta pangleyur A (0,08% asam format) sareng pangleyur B (0,15% asam format dina 80% asetonitril). Sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) dianggo pikeun ngélutékeun kolom nganggo pangleyur A dina 55 menit dina laju aliran 50 μl min-1 salami 5 menit, teras konsentrasi pangleyur B ningkat janten 40%. (Amérika Serikat). Eluat terus-terusan diasupkeun kana sumber ion ESI, sareng péptida triptik sareng péptida nganggo GPI-glikan dianalisis ku LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa trap-orbitrap ion linier hibrida; Thermo Fisher Scientific). Dina setelan MS, tegangan sumber kapiler disetel ka 4,5 kV, sareng suhu kapiler transfer dijaga dina 300°C. Tegangan kapiler sareng tegangan lénsa tabung disetel ka 15 V sareng 50 V, masing-masing. Data MS diala dina modeu ion positif (résolusi 60.000; akurasi massa 10 bagian per juta) dina rentang massa 300/m/z babandingan massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS diala ngaliwatan bubu ion dina LTQ Orbitrap XL [3 angka munggaran anu jadi dadasar data, disosiasi anu diinduksi tabrakan (CID)].
Simulasi MD dilakukeun nganggo parangkat lunak GROMACS (52) sareng medan gaya MARTINI 2 (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) teras dianggo pikeun ngawangun lapisan ganda anu ngandung dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) sareng Cer C18 atanapi DOPC sareng Cer C26. Topologi sareng koordinat Cer C26 diturunkeun tina DXCE ku cara miceun manik-manik tambahan tina buntut sphingosine. Anggo prosés anu dijelaskeun di handap ieu pikeun ngimbangan lapisan ganda sareng ngajalankeunana, teras anggo koordinat terakhir sistem pikeun ngawangun sistem anu ngandung Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (résidu 173 dugi ka 193) diwangun salaku α-helix nganggo struktur molekul alat visual MD (VMD) (58). Teras, saatos miceun lipid anu tumpang tindih, protéinna digranulasi sacara kasar sareng dilebetkeun kana lapisan ganda nganggo CHARMM GUI. Sistem ahir ngandung 1202 DOPC sareng 302 Cer C26 atanapi 1197 DOPC sareng 295 Cer C18 sareng Emp24. Ionisasi sistem dugi ka konsentrasi 0,150M. Opat réplikasi mandiri dilakukeun pikeun dua komposisi lapisan ganda.
Lapisan lipid diimbangan nganggo prosés CHARMM GUI, anu ngalibatkeun ngaminimalkeun teras ngimbangan 405.000 léngkah, dimana kendala posisi laun-laun dikirangan sareng dihapus, sareng léngkah waktos ningkat tina 0,005 ps janten 0,02 ps. Saatos kasaimbangan, éta ngahasilkeun 6 µs kalayan léngkah waktos 0,02 ps. Saatos nyelapkeun Emp24, anggo prosés CHARMM GUI anu sami pikeun ngaminimalkeun sareng ngimbangan sistem, teras jalankeun salami 8 detik dina produksi.
Pikeun sadaya sistem, salami prosés kasaimbangan, tekanan dikontrol ku barostat Berendsen (59), sareng salami prosés produksi, tekanan dikontrol ku barostat Parrinello-Rahman (60). Dina sadaya kasus, tekanan rata-rata nyaéta 1 bar sareng skéma gandeng tekanan semi-isotropik dianggo. Dina prosés kasaimbangan sareng produksi, termostat (61) kalayan kalibrasi ulang kecepatan dianggo pikeun ngahijikeun suhu protéin, lipid sareng partikel pangleyur masing-masing. Salila sakabéh operasi, suhu target nyaéta 310K. Interaksi non-beungkeutan diitung ku cara ngahasilkeun daptar pasangan nganggo skéma Verlet kalayan toleransi buffer 0,005. Istilah Coulomb diitung nganggo widang réaksi sareng jarak cut-off 1,1 nm. Istilah Vander Waals nganggo skéma cut-off kalayan jarak cut-off 1,1 nm, sareng skéma cut-off Verlet dianggo pikeun poténsi hanyutan (62).
Ngagunakeun VMD, panjang gelombang cutoff antara manik-manik fosfat DOPC atanapi manik-manik seramida AM1 sareng protéinna nyaéta 0,7 nm, sareng jumlah lipid anu berinteraksi sareng protéinna diitung. Numutkeun rumus ieu, itung faktor pengayaan deplesi (DE) sapertos dina (63): Faktor DE = (jumlah total lipid dina protéin 0,7) dina protéin 0,7 (jumlah Cer dina total lipid)
Nilai anu dilaporkeun diala salaku rata-rata, sareng bilah kasalahan nyaéta opat salinan SE anu mandiri. Signifikansi statistik faktor DE diitung ku uji t [(averageDE-factor-1)/SE]. Hitung nilai P tina distribusi hiji-sisi.
Pakakas GROMACS dianggo pikeun ngitung peta kapadetan lateral 2D tina sistem anu ngandung Emp24 dina 250 ns terakhir tina trace. Pikeun kéngingkeun peta pangayaan/deplesi seramida, peta kapadetan Cer dibagi ku jumlah peta Cer sareng DOPC, teras dibagi ku konsentrasi Cer dina awak. Skala peta warna anu sami dianggo.
Kanggo bahan tambahan pikeun tulisan ieu, mangga tingali http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ieu mangrupikeun artikel aksés kabuka anu disebarkeun dina istilah Lisénsi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, anu ngamungkinkeun panggunaan, distribusi sareng réproduksi dina média naon waé, salami panggunaan akhir sanés pikeun kauntungan komérsial sareng premisna nyaéta karya aslina leres. Rujukan.
Catetan: Kami ngan ukur nyuhunkeun anjeun pikeun masihan alamat email anjeun supados jalmi anu anjeun rekomendasikeun ka halaman éta terang yén anjeun hoyong aranjeunna ningali email éta sareng éta sanés spam. Kami moal ngarékam alamat email naon waé.
Patarosan ieu dianggo pikeun nguji naha anjeun pangunjung sareng nyegah kiriman spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Lopez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi luhur 3D ngungkabkeun pentingna panjang ranté seramida pikeun pamilahan protéin dina situs kaluaran selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero (Sergio Lopez), Misaho Lopez (Sergio Lopez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi luhur 3D ngungkabkeun pentingna panjang ranté seramida pikeun pamilahan protéin dina situs kaluaran selektif.
© 2020 Asosiasi Amérika pikeun Kamajuan Élmu. sadaya hak disimpen. AAAS mangrupikeun mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef sareng COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.