Kami sateuacanna ngalaporkeun yén kadar sérum metabolit triptofan anu diturunkeun tina peujit, asam indol-3-propionat (IPA) langkung handap dina pasien anu ngagaduhan fibrosis ati. Dina panilitian ieu, kami nalungtik transkriptom sareng DNA metilom dina ati anu obesitas dina hubunganana sareng kadar IPA sérum, ogé peran IPA dina ngainduksi inaktivasi fenotipik sél stellata hepatik (HSC) in vitro.
Panilitian ieu ngawengku 116 pasién obesitas tanpa diabetes mellitus tipe 2 (T2DM) (umur 46,8 ± 9,3 taun; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) anu ngalaman operasi bariatrik di Pusat Bedah Bariatrik Kuopio (KOBS). Kadar IPA anu sirkulasi diukur ku kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), analisis transkriptom ati dilakukeun ku sekuensing RNA total, sareng analisis metilasi DNA dilakukeun nganggo Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Sél stellata hepatik manusa (LX-2) dianggo pikeun ékspérimén in vitro.
Kadar IPA sérum aya hubunganana sareng éksprési gén anu kalibet dina jalur apoptotik, mitofagik, sareng umur panjang dina ati. Gén AKT serin/treonin kinase 1 (AKT1) mangrupikeun gén anu paling seueur sareng dominan anu berinteraksi dina transkrip ati sareng profil metilasi DNA. Perawatan IPA ngainduksi apoptosis, ngirangan réspirasi mitokondria, sareng ngarobih morfologi sél sareng dinamika mitokondria ku cara modulasi éksprési gén anu dipikanyaho ngatur fibrosis, apoptosis, sareng survival sél LX-2.
Sacara gembleng, data ieu ngadukung yén IPA gaduh épék terapi poténsial sareng tiasa nimbulkeun apoptosis sareng ngarobih fenotipe HSC ka kaayaan teu aktif, sahingga ngalegaan kamungkinan ngahambat fibrosis ati ku cara ngaganggu aktivasina HSC sareng métabolisme mitokondria.
Prévalénsi obesitas sareng sindrom métabolik parantos dikaitkeun sareng ningkatna insiden panyakit ati lemak anu aya hubunganana sacara métabolik (MASLD); panyakit ieu mangaruhan 25% dugi ka 30% tina populasi umum [1]. Akibat utama tina étiologi MASLD nyaéta fibrosis ati, prosés dinamis anu dicirikeun ku akumulasi matriks ékstrasélular fibrosa (ECM) anu terus-terusan [2]. Sél utama anu kalibet dina fibrosis ati nyaéta sél stellata hepatik (HSC), anu nunjukkeun opat fenotipe anu dipikanyaho: quiescent, activated, inactivated, sareng senescent [3, 4]. HSC tiasa diaktipkeun sareng transdifferensiasi tina bentuk quiescent kana sél sapertos fibroblast proliferatif kalayan paménta énergi anu luhur, kalayan ningkatna éksprési aktin otot polos α (α-SMA) sareng kolagén tipe I (Col-I) [5, 6]. Salila pambalikan fibrosis ati, HSC anu diaktipkeun dieliminasi ngalangkungan apoptosis atanapi inaktivasi. Prosés ieu kalebet downregulation gén fibrogenik sareng modulasi gén prosurvival (sapertos jalur sinyal NF-κB sareng PI3K/Akt) [7, 8], ogé parobahan dina dinamika sareng fungsi mitokondria [9].
Kadar sérum metabolit triptofan asam indol-3-propionat (IPA), anu dihasilkeun dina peujit, parantos kapendak turun dina panyakit métabolik manusa kalebet MASLD [10–13]. IPA aya hubunganana sareng asupan serat dietary, dipikanyaho ku épék antioksidan sareng anti radangna, sareng ngaleuleuskeun fenotipe steatohepatitis non-alkohol (NASH) anu diinduksi ku diet in vivo sareng in vitro [11–14]. Sababaraha bukti asalna tina panilitian kami sateuacanna, anu nunjukkeun yén kadar IPA sérum langkung handap dina pasien fibrosis ati tibatan pasien obesitas tanpa fibrosis ati dina Studi Bedah Bariatric Kuopio (KOBS). Salajengna, kami nunjukkeun yén pangobatan IPA tiasa ngirangan éksprési gén anu mangrupikeun spidol klasik tina adhesi sél, migrasi sél sareng aktivasi sél stém hematopoietik dina modél sél stellate hepatik manusa (LX-2) sareng mangrupikeun metabolit hepatoprotektif poténsial [15]. Nanging, masih teu jelas kumaha IPA ngainduksi régrési fibrosis ati ku cara ngaktipkeun apoptosis HSC sareng bioenergetika mitokondria.
Di dieu, urang nunjukkeun yén sérum IPA aya hubunganana sareng éksprési gén anu beunghar ku apoptosis, mitophagy, sareng jalur umur panjang dina ati jalma anu obesitas tapi sanés diabetes tipe 2 (KOBS). Salajengna, urang mendakan yén IPA tiasa ngainduksi clearance sareng degradasi sél stém hématopoietik (HSC) anu diaktipkeun ngalangkungan jalur inaktivasi. Hasil ieu ngungkabkeun peran anyar pikeun IPA, jantenkeun target terapi poténsial pikeun ngamajukeun régrési fibrosis ati.
Panilitian sateuacanna dina kohort KOBS nunjukkeun yén pasién anu ngagaduhan fibrosis ati ngagaduhan tingkat IPA sirkulasi anu langkung handap dibandingkeun sareng pasién anu henteu ngagaduhan fibrosis ati [15]. Pikeun ngaluarkeun poténsi pangaruh ngabingungkeun tina diabetes tipe 2, kami ngarékrut 116 pasién obesitas tanpa diabetes tipe 2 (umur rata-rata ± SD: 46,8 ± 9,3 taun; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabel 1) tina panilitian KOBS anu lumangsung salaku populasi panilitian [16]. Sadaya pamilon masihan idin tinulis sareng protokol panilitian disatujuan ku Komite Étika Rumah Sakit Kabupaten Savo Kalér saluyu sareng Déklarasi Helsinki (54/2005, 104/2008 sareng 27/2010).
Spésimén biopsi ati dicandak nalika operasi bariatrik sareng dipariksa sacara histologis ku ahli patologi anu berpengalaman numutkeun kriteria anu parantos dijelaskeun sateuacanna [17, 18]. Kriteria penilaian diringkeskeun dina Tabel Tambahan S1 sareng parantos dijelaskeun sateuacanna [19].
Sampel sérum puasa dianalisis ku kromatografi cair-spektrometri massa anu teu dituju (LC-MS) pikeun analisis metabolomik (n = 116). Sampel dianalisis nganggo sistem UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Jerman) sapertos anu dijelaskeun sateuacanna19. Idéntifikasi alkohol isopropil (IPA) dumasar kana waktos ingetan sareng babandingan spéktrum MS/MS sareng standar murni. Inténsitas sinyal IPA (daérah puncak) dipertimbangkeun dina sadaya analisis salajengna [20].
Sekuensing RNA ati sakabéhna dilakukeun nganggo Illumina HiSeq 2500 sareng data diprosés sateuacanna sapertos anu dijelaskeun sateuacanna [19, 21, 22]. Kami ngalaksanakeun analisis éksprési diferensial anu ditujukeun tina transkrip anu mangaruhan fungsi/biogenesis mitokondria nganggo 1957 gén anu dipilih tina database MitoMiner 4.0 [23]. Analisis métilasi DNA ati dilakukeun nganggo Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) nganggo metodologi anu sami sapertos anu dijelaskeun sateuacanna [24, 25].
Sél stellata hepatik manusa (LX-2) disayogikeun ku Prof. Stefano Romeo sareng dibudidayakeun sareng dijaga dina média DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Pikeun milih dosis kerja IPA, sél LX-2 dirawat ku konsentrasi IPA anu béda (10 μM, 100 μM sareng 1 mM; Sigma, 220027) dina média DMEM/F12 salami 24 jam. Salajengna, pikeun nalungtik kamampuan IPA pikeun nganonaktipkeun HSC, sél LX-2 dirawat babarengan ku 5 ng/ml TGF-β1 (sistem R&D, 240-B-002/CF) sareng 1 mM IPA dina média bébas sérum salami 24 jam. Pikeun kontrol kandaraan anu saluyu, 4 nM HCL anu ngandung 0,1% BSA dianggo pikeun perlakuan TGF-β1 sareng 0,05% DMSO dianggo pikeun perlakuan IPA, sareng duanana dianggo babarengan pikeun perlakuan kombinasi.
Apoptosis dipeunteun nganggo FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit sareng 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) numutkeun pitunjuk produsén. Sacara singget, LX-2 (1 × 105 sél/sumur) dibudidayakeun sapeuting dina piring 12-sumur teras dirawat ku sababaraha dosis IPA atanapi IPA sareng TGF-β1. Isukna, sél anu ngambang sareng anu napel dikumpulkeun, ditripsinasi, dikumbah ku PBS, disuspensikeun deui dina buffer pangiket Annexin V, sareng diinkubasi ku FITC-Annexin V sareng 7-AAD salami 15 menit.
Mitokondria dina sél hirup diwarnaan pikeun aktivitas oksidatif nganggo Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Pikeun uji MTR, sél LX-2 diinkubasi dina kapadetan anu sami sareng IPA sareng TGF-β1. Saatos 24 jam, sél hirup ditripsinasi, dikumbah ku PBS, teras diinkubasi ku 100 μM MTR dina média bébas sérum dina suhu 37 °C salami 20 menit sapertos anu dijelaskeun sateuacanna [26]. Pikeun analisis morfologi sél hirup, ukuran sél sareng kompleksitas sitoplasma dianalisis nganggo parameter forward scatter (FSC) sareng side scatter (SSC).
Sadaya data (30.000 kajadian) diala nganggo NovoCyte Quanteon (Agilent) sareng dianalisis nganggo NovoExpress® 1.4.1 atanapi parangkat lunak FlowJo V.10.
Laju konsumsi oksigén (OCR) sareng laju pengasaman ékstrasélular (ECAR) diukur sacara real time nganggo Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) anu dilengkepan ku Seahorse XF Cell Mito Stress numutkeun pitunjuk produsén. Sacara singget, 2 × 104 sél LX-2/sumur dipelak dina pelat kultur sél XF96. Saatos inkubasi sapeuting, sél dirawat ku isopropanol (IPA) sareng TGF-β1 (Métode Tambahan 1). Analisis data dilakukeun nganggo parangkat lunak Seahorse XF Wave, anu kalebet Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Tina ieu, Indéks Kaséhatan Bioenergetik (BHI) diitung [27].
RNA total ditranskripsi kana cDNA. Pikeun metode khusus, tingali rujukan [15]. Kadar mRNA protéin asam ribosom 60S manusa P0 (RPLP0) sareng siklofilin A1 (PPIA) dianggo salaku kontrol gén konstitutif. Sistem PCR Real-Time QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Walanda) dianggo sareng TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) atanapi Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), sareng lipatan éksprési gén relatif diitung nganggo parameter siklus nilai Ct komparatif (ΔΔCt) sareng metode ∆∆Ct. Rincian primer disayogikeun dina Tabel Tambahan S2 sareng S3.
DNA inti (ncDNA) sareng DNA mitokondria (mtDNA) diekstrak nganggo kit getih sareng jaringan DNeasy (Qiagen) sapertos anu dijelaskeun sateuacanna [28]. Jumlah relatif mtDNA diitung ku cara ngitung babandingan unggal daérah mtDNA target kana rata-rata géométri tina tilu daérah DNA inti (mtDNA/ncDNA), sapertos anu dijelaskeun dina Métode Tambahan 2. Rincian primer pikeun mtDNA sareng ncDNA disayogikeun dina Tabel Tambahan S4.
Sél hirup diwarnaan ku Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) pikeun ngavisualisasikeun jaringan mitokondria intersélular sareng intrasélular. Sél LX-2 (1 × 104 sél/sumur) dikultur dina slide kaca dina pelat kultur anu aya dasarna kaca (Ibidi GmbH, Martinsried, Jerman). Saatos 24 jam, sél LX-2 hirup diinkubasi ku 100 μM MTR salami 20 menit dina suhu 37 °C sareng inti sél diwarnaan ku DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) sapertos anu dijelaskeun sateuacanna [29]. Jaringan mitokondria divisualisasikeun nganggo mikroskop tibalik Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman) anu dilengkepan modul confocal Zeiss LSM 800 dina suhu 37 °C dina atmosfir anu lembab kalayan 5% CO2 nganggo objektif 63 × NA 1.3. Kami kéngingkeun sapuluh gambar séri-Z pikeun unggal jinis sampel. Unggal séri-Z ngandung 30 bagian, masing-masing kalayan ketebalan 9,86 μm. Pikeun unggal sampel, gambar tina sapuluh widang pandang anu béda diala nganggo parangkat lunak ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman), sareng analisis morfologi mitokondria dilakukeun nganggo parangkat lunak ImageJ (v1.54d) [30, 31] numutkeun parameter anu dirinci dina Métode Tambahan 3.
Sél-sélna difiksasi ku 2% glutaraldehida dina buffer fosfat 0,1 M, dituturkeun ku fiksasi ku larutan osmium tetroksida 1% (Sigma Aldrich, MO, AS), laun-laun didehidrasi ku aseton (Merck, Darmstadt, Jerman), sareng pamustunganana ditancapkeun kana résin époksi. Bagian anu ipis pisan disiapkeun sareng diwarnaan ku 1% uranil asetat (Merck, Darmstadt, Jerman) sareng 1% timbal sitrat (Merck, Darmstadt, Jerman). Gambar ultrastruktural diala nganggo mikroskop éléktron transmisi JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Jepang) dina tegangan akselerasi 80 kV.
Morfologi sél LX-2 anu dirawat ku IPA salami 24 jam dianalisis ku mikroskop fase-kontras dina pembesaran 50x nganggo mikroskop cahaya terbalik Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 sareng AxioCam MRm, Jena, Jerman).
Data klinis dikedalkeun salaku rata-rata ± simpangan baku atanapi median (rentang interkuartil: IQR). Analisis varian hiji arah (variabel kontinyu) atanapi uji χ² (variabel kategoris) dianggo pikeun ngabandingkeun bédana antara tilu kelompok panilitian. Laju positif palsu (FDR) dianggo pikeun ngabenerkeun sababaraha tés, sareng gén kalayan FDR <0,05 dianggap signifikan sacara statistik. Analisis korélasi Spearman dianggo pikeun ngahubungkeun métilasi DNA CpG sareng inténsitas sinyal IPA, kalayan nilai p nominal (p <0,05) dilaporkeun.
Analisis jalur dilaksanakeun nganggo alat analisis set gén berbasis wéb (WebGestalt) pikeun 268 transkrip (nominal p < 0,01), 119 transkrip anu aya hubunganana sareng mitokondria (nominal p < 0,05), sareng 4350 CpG tina 3093 transkrip ati anu aya hubunganana sareng tingkat IPA sérum anu sirkulasi. Alat Venny DB (versi 2.1.0) anu sayogi sacara gratis dianggo pikeun mendakan gén anu tumpang tindih, sareng StringDB (versi 11.5) dianggo pikeun ngabayangkeun interaksi protéin-protéin.
Pikeun ékspérimén LX-2, sampel diuji normalitasna nganggo uji D'Agostino-Pearson. Data diala tina sahenteuna tilu réplikasi biologis sareng diuji ANOVA hiji arah nganggo uji post hoc Bonferroni. Nilai-p kirang ti 0,05 dianggap signifikan sacara statistik. Data dipidangkeun salaku rata-rata ± SD, sareng jumlah ékspérimén dituduhkeun dina unggal gambar. Sadaya analisis sareng grafik dilakukeun nganggo parangkat lunak statistik GraphPad Prism 8 pikeun Windows (GraphPad Software Inc., vérsi 8.4.3, San Diego, AS).
Mimitina, urang nalungtik hubungan kadar IPA sérum jeung transkrip ati, sakujur awak, jeung mitokondria. Dina profil transkrip total, gén pangkuatna anu pakait jeung kadar IPA sérum nyaéta MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; protéin kinase anu diaktipkeun ku mitogen-activated protein kinase 3); dina profil transkrip anu patali jeung mitokondria, gén anu pakait pangkuatna nyaéta AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/treonin kinase 1) (File tambahan 1 jeung File tambahan 2).
Teras kami nganalisis transkrip global (n = 268; p < 0,01) sareng transkrip anu aya hubunganana sareng mitokondria (n = 119; p < 0,05), anu pamustunganana ngaidentipikasi apoptosis salaku jalur kanonik anu paling penting (p = 0,0089). Pikeun transkrip mitokondria anu aya hubunganana sareng tingkat IPA sérum, kami fokus kana apoptosis (FDR = 0,00001), mitofagi (FDR = 0,00029), sareng jalur sinyal TNF (FDR = 0,000006) (Gambar 1A, Tabel 2, sareng Gambar Tambahan 1A-B).
Analisis tumpang tindih transkrip global, anu aya hubunganana sareng mitokondria, sareng metilasi DNA dina ati manusa anu aya hubunganana sareng tingkat IPA sérum. A ngawakilan 268 transkrip global, 119 transkrip anu aya hubunganana sareng mitokondria, sareng transkrip DNA anu dimetilasi anu dipetakan ka 3092 situs CpG anu aya hubunganana sareng tingkat IPA sérum (nilai p < 0,01 pikeun transkrip global sareng DNA anu dimetilasi, sareng nilai p < 0,05 pikeun transkrip mitokondria). Transkrip tumpang tindih utama dipidangkeun di tengah (AKT1 sareng YKT6). B Peta interaksi 13 gén kalayan skor interaksi pangluhurna (0,900) sareng gén sanés diwangun tina 56 gén anu tumpang tindih (daérah garis hideung) anu sacara signifikan aya hubunganana sareng tingkat IPA sérum nganggo alat online StringDB. Héjo: Gén anu dipetakan kana komponén sélular Ontologi Gén (GO): mitokondria (GO: 0005739). AKT1 nyaéta protéin kalayan skor pangluhurna (0,900) pikeun interaksi sareng protéin sanés dumasar kana data (dumasar kana panambangan téks, ékspérimén, basis data, sareng ko-éksprési). Node jaringan ngagambarkeun protéin, sedengkeun sisi-sisina ngagambarkeun hubungan antara protéin.
Kusabab metabolit mikrobiota peujit tiasa ngatur komposisi épigenetik ngalangkungan métilasi DNA [32], kami nalungtik naha tingkat IPA sérum aya hubunganana sareng métilasi DNA ati. Kami mendakan yén dua situs métilasi utama anu aya hubunganana sareng tingkat IPA sérum nyaéta caket daérah beunghar prolin-serin 3 (C19orf55) sareng protéin kejut panas kulawarga B (leutik) anggota 6 (HSPB6) (File tambahan 3). Métilasi DNA 4350 CpG (p <0,01) aya hubunganana sareng tingkat IPA sérum sareng diperkaya dina jalur pangaturan umur panjang (p = 0,006) (Gambar 1A, Tabel 2, sareng Gambar Tambahan 1C).
Pikeun ngartos mékanisme biologis anu aya hubunganana antara tingkat IPA sérum, transkrip global, transkrip anu aya hubunganana sareng mitokondria, sareng metilasi DNA dina ati manusa, kami ngalaksanakeun analisis tumpang tindih tina gén anu diidentipikasi dina analisis jalur sateuacana (Gambar 1A). Hasil analisis pangayaan jalur tina 56 gén anu tumpang tindih (di jero garis hideung dina Gambar 1A) nunjukkeun yén jalur apoptosis (p = 0,00029) nyorot dua gén anu umum pikeun tilu analisis: AKT1 sareng YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), sapertos anu dipidangkeun dina diagram Venn (Gambar Tambahan 2 sareng Gambar 1A). Anu pikaresepeun, kami mendakan yén AKT1 (cg19831386) sareng YKT6 (cg24161647) berkorelasi positif sareng tingkat IPA sérum (File Tambahan 3). Pikeun ngaidentipikasi interaksi protéin poténsial antara produk gén, kami milih 13 gén kalayan skor daérah umum pangluhurna (0,900) di antara 56 gén anu tumpang tindih salaku input sareng ngawangun peta interaksi. Numutkeun tingkat kapercayaan (kapercayaan marginal), gén AKT1 anu gaduh skor pangluhurna (0,900) aya di luhur (Gambar 1B).
Dumasar kana analisis jalur, urang mendakan yén apoptosis mangrupikeun jalur utama, janten urang nalungtik naha pangobatan IPA bakal mangaruhan apoptosis HSC sacara in vitro. Kami sateuacanna nunjukkeun yén dosis IPA anu béda (10 μM, 100 μM, sareng 1 mM) henteu toksik pikeun sél LX-2 [15]. Panilitian ieu nunjukkeun yén pangobatan IPA dina 10 μM sareng 100 μM ningkatkeun jumlah sél anu hirup sareng nekrotik. Nanging, dibandingkeun sareng kelompok kontrol, daya tahan sél turun dina konsentrasi IPA 1 mM, sedengkeun laju nekrosis sél tetep teu robih (Gambar 2A, B). Salajengna, pikeun mendakan konsentrasi optimal pikeun ngainduksi apoptosis dina sél LX-2, urang nguji 10 μM, 100 μM, sareng 1 mM IPA salami 24 jam (Gambar 2A-E sareng Gambar Tambahan 3A-B). Anu pikaresepeun nyaéta, IPA 10 μM sareng 100 μM nurunkeun laju apoptosis (%), nanging, IPA 1 mM ningkatkeun laju apoptosis sareng apoptosis telat (%) dibandingkeun sareng kontrol sareng ku kituna dipilih pikeun ékspérimén salajengna (Gambar 2A–D).
IPA ngainduksi apoptosis sél LX-2. Métode pewarnaan ganda Annexin V sareng 7-AAD dianggo pikeun ngitung laju apoptosis sareng morfologi sél ku flow cytometry. Sél BA diinkubasi sareng 10 μM, 100 μM sareng 1 mM IPA salami 24 jam atanapi sareng F–H TGF-β1 (5 ng/ml) sareng 1 mM IPA dina média bébas sérum salami 24 jam. A: sél hirup (Annexin V -/ 7AAD-); B: sél nekrotik (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: awal (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: akhir (Annexin V+/7AAD.+); E, H: perséntase total sél apoptosis awal sareng akhir dina laju apoptosis (%). Data dikedalkeun salaku rata-rata ± SD, n = 3 ékspérimén mandiri. Babandingan statistik dilakukeun nganggo ANOVA hiji arah sareng tés post hoc Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0.0001
Sapertos anu parantos dipidangkeun sateuacanna, 5 ng/ml TGF-β1 tiasa ngainduksi aktivasi HSC ku cara ningkatkeun éksprési gén pananda klasik [15]. Sél LX-2 dirawat ku 5 ng/ml TGF-β1 sareng 1 mM IPA dina kombinasi (Gambar 2E–H). Perawatan TGF-β1 henteu ngarobih laju apoptosis, nanging, perawatan babarengan IPA ningkatkeun laju apoptosis sareng apoptosis telat (%) dibandingkeun sareng perawatan TGF-β1 (Gambar 2E–H). Hasil ieu nunjukkeun yén 1 mM IPA tiasa ngamajukeun apoptosis dina sél LX-2 sacara mandiri tina induksi TGF-β1.
Kami salajengna nalungtik pangaruh IPA kana réspirasi mitokondria dina sél LX-2. Hasilna nunjukkeun yén 1 mM IPA nurunkeun parameter laju konsumsi oksigén (OCR): réspirasi non-mitokondria, réspirasi basal sareng maksimal, bocor proton sareng produksi ATP dibandingkeun sareng kelompok kontrol (Gambar 3A, B), sedengkeun indéks kaséhatan bioénergi (BHI) henteu robih.
IPA ngirangan réspirasi mitokondria dina sél LX-2. Kurva réspirasi mitokondria (OCR) dipidangkeun salaku parameter réspirasi mitokondria (réspirasi non-mitokondria, réspirasi basal, réspirasi maksimal, bocor proton, generasi ATP, SRC sareng BHI). Sél A sareng B diinkubasi ku 10 μM, 100 μM sareng 1 mM IPA salami 24 jam. Sél C ​​sareng D diinkubasi ku TGF-β1 (5 ng/ml) sareng 1 mM IPA dina média bébas sérum salami 24 jam. Sadaya pangukuran dinormalisasi kana eusi DNA nganggo kit CyQuant. BHI: indéks kaséhatan bioénergi; SRC: kapasitas cadangan réspirasi; OCR: laju konsumsi oksigén. Data dipidangkeun salaku rata-rata ± simpangan baku (SD), n = 5 ékspérimén mandiri. Babandingan statistik dilakukeun nganggo ANOVA hiji arah sareng tés post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; sareng ***p < 0,001
Pikeun kéngingkeun pamahaman anu langkung lengkep ngeunaan pangaruh IPA kana profil bioénergi sél LX-2 anu diaktipkeun TGF-β1, kami nganalisis fosforilasi oksidatif mitokondria ku OCR (Gambar 3C, D). Hasilna nunjukkeun yén perlakuan TGF-β1 tiasa ngirangan réspirasi maksimum, kapasitas cadangan réspirasi (SRC) sareng BHI dibandingkeun sareng kelompok kontrol (Gambar 3C, D). Salaku tambahan, perlakuan kombinasi ngirangan réspirasi basal, bocor proton sareng produksi ATP, tapi SRC sareng BHI sacara signifikan langkung luhur tibatan anu dirawat ku TGF-β1 (Gambar 3C, D).
Kami ogé ngalaksanakeun "Tés Fenotipe Énergi Sélulér" anu disayogikeun ku parangkat lunak Seahorse (Gambar Tambahan 4A–D). Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar Tambahan 3B, poténsi métabolik OCR sareng ECAR turun saatos perlakuan TGF-β1, kumaha ogé, teu aya bédana anu dititénan dina kelompok perlakuan kombinasi sareng IPA dibandingkeun sareng kelompok kontrol. Salajengna, tingkat basal sareng setrés OCR turun saatos perlakuan kombinasi sareng IPA dibandingkeun sareng kelompok kontrol (Gambar Tambahan 4C). Anu pikaresepeun, pola anu sami dititénan sareng terapi kombinasi, dimana teu aya parobahan dina tingkat basal sareng setrés ECAR anu dititénan dibandingkeun sareng perlakuan TGF-β1 (Gambar Tambahan 4C). Dina HSC, réduksi fosforilasi oksidatif mitokondria sareng kamampuan perlakuan kombinasi pikeun mulangkeun SCR sareng BHI saatos paparan perlakuan TGF-β1 henteu ngarobih poténsi métabolik (OCR sareng ECAR). Sacara gembleng, hasil ieu nunjukkeun yén IPA tiasa ngirangan bioénergi dina HSC, nunjukkeun yén IPA tiasa ngainduksi profil énergi anu langkung handap anu ngarobih fenotipe HSC nuju inaktivasi (Gambar Tambahan 4D).
Pangaruh IPA kana dinamika mitokondria ditalungtik nganggo kuantifikasi tilu diménsi morfologi mitokondria sareng sambungan jaringan ogé pewarnaan MTR (Gambar 4 sareng Gambar Tambahan 5). Gambar 4 nunjukkeun yén, dibandingkeun sareng kelompok kontrol, perlakuan TGF-β1 ngirangan luas permukaan rata-rata, jumlah cabang, panjang cabang total, sareng jumlah sambungan cabang (Gambar 4A sareng B) sareng ngarobih proporsi mitokondria tina morfologi buleud ka sedeng (Gambar 4C). Ngan perlakuan IPA anu ngirangan volume mitokondria rata-rata sareng ngarobih proporsi mitokondria tina morfologi buleud ka sedeng dibandingkeun sareng kelompok kontrol (Gambar 4A). Sabalikna, sferisitas, panjang cabang rata-rata, sareng aktivitas mitokondria anu ditaksir ku MTR anu gumantung kana poténsi mémbran mitokondria (Gambar 4A sareng E) tetep teu robih sareng parameter ieu henteu bénten antara kelompok. Sacara gembleng, hasil ieu nunjukkeun yén perlakuan TGF-β1 sareng IPA sigana ngamodulasi bentuk sareng ukuran mitokondria ogé kompleksitas jaringan dina sél LX-2 anu hirup.
IPA ngarobih dinamika mitokondria sareng kaayaan DNA mitokondria dina sél LX-2. A. Gambar confocal répréséntatif sél LX-2 hirup anu diinkubasi ku TGF-β1 (5 ng/ml) sareng 1 mM IPA salami 24 jam dina média bébas sérum anu nunjukkeun jaringan mitokondria anu diwarnaan ku Mitotracker™ Red CMXRos sareng inti anu diwarnaan biru ku DAPI. Sadaya data ngandung sahenteuna 15 gambar per grup. Kami kéngingkeun 10 gambar tumpukan-Z pikeun unggal jinis sampel. Unggal runtuyan sumbu-Z ngandung 30 irisan, masing-masing kalayan ketebalan 9,86 μm. Bilah skala: 10 μm. B. Objek répréséntatif (mitokondria hungkul) diidentipikasi ku cara nerapkeun ambang batas adaptif kana gambar. Analisis kuantitatif sareng babandingan sambungan jaringan morfologis mitokondria dilakukeun pikeun sadaya sél dina unggal grup. C. Frékuénsi babandingan bentuk mitokondria. Nilai anu caket kana 0 nunjukkeun bentuk buleud, sareng nilai anu caket kana 1 nunjukkeun bentuk filamén. D Eusi DNA mitokondria (mtDNA) ditangtukeun sapertos anu dijelaskeun dina Bahan sareng Métode. Analisis E Mitotracker™ Red CMXRos dilakukeun ku flow cytometry (30.000 kajadian) sakumaha anu dijelaskeun dina Bahan sareng Métode. Data dipidangkeun salaku rata-rata ± SD, n = 3 ékspérimén mandiri. Babandingan statistik dilakukeun nganggo ANOVA hiji arah sareng uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Teras kami nganalisis eusi mtDNA dina sél LX-2 salaku indikator jumlah mitokondria. Dibandingkeun sareng kelompok kontrol, eusi mtDNA ningkat dina kelompok anu dirawat TGF-β1 (Gambar 4D). Dibandingkeun sareng kelompok anu dirawat TGF-β1, eusi mtDNA turun dina kelompok perlakuan kombinasi (Gambar 4D), nunjukkeun yén IPA tiasa ngirangan eusi mtDNA sareng kamungkinan jumlah mitokondria ogé réspirasi mitokondria (Gambar 3C). Leuwih ti éta, IPA sigana ngirangan eusi mtDNA dina perlakuan kombinasi tapi henteu mangaruhan aktivitas mitokondria anu dimediasi MTR (Gambar 4A–C).
Kami nalungtik hubungan IPA sareng tingkat mRNA gén anu aya hubunganana sareng fibrosis, apoptosis, survival, sareng dinamika mitokondria dina sél LX-2 (Gambar 5A–D). Dibandingkeun sareng kelompok kontrol, kelompok anu dirawat TGF-β1 nunjukkeun paningkatan éksprési gén sapertos ranté α2 tipe I kolagén (COL1A2), aktin otot polos α (αSMA), matriks metalloproteinase 2 (MMP2), inhibitor jaringan metalloproteinase 1 (TIMP1), sareng gén sapertos dinamin 1 (DRP1), nunjukkeun paningkatan fibrosis sareng aktivasina. Salajengna, dibandingkeun sareng kelompok kontrol, perawatan TGF-β1 ngirangan tingkat mRNA reséptor pregnane X nuklir (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor sél-B α, peningkat péptida cahaya gén faktor nuklir κ (NFκB1A), sareng inhibitor subunit kinase faktor nuklir κB β (IKBKB) (Gambar 5A–D). Dibandingkeun sareng pangobatan TGF-β1, pangobatan kombinasi sareng TGF-β1 sareng IPA ngirangan éksprési COL1A2 sareng MMP2, tapi ningkatkeun tingkat mRNA PXR, TIMP1, limfoma sél-B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, sareng IKBKB. Pangobatan IPA sacara signifikan ngirangan éksprési MMP2, protéin X anu aya hubunganana sareng Bcl-2 (BAX), AKT1, protéin atrofi optik 1 (OPA1), sareng protéin fusi mitokondria 2 (MFN2), sedengkeun éksprési CASP8, NFκB1A, NFκB1B, sareng IKBKB ningkat dibandingkeun sareng kelompok kontrol. Nanging, teu aya bédana anu kapendak dina éksprési caspase-3 (CASP3), faktor pangaktif peptidase apoptotik 1 (APAF1), protéin fusi mitokondria 1 (MFN1), sareng protéin fisi 1 (FIS1). Sacara koléktif, hasil ieu nunjukkeun yén pangobatan IPA ngamodulasi éksprési gén anu aya hubunganana sareng fibrosis, apoptosis, survival, sareng dinamika mitokondria. Data kami nunjukkeun yén pangobatan IPA ngirangan fibrosis dina sél LX-2; dina waktos anu sami, éta ngarangsang survival ku cara mindahkeun fenotipe ka arah inaktivasi.
IPA ngamodulasi éksprési gén fibroblast, apoptotik, viabilitas, sareng dinamika mitokondria dina sél LX-2. Histogram nampilkeun éksprési mRNA relatif ka kontrol éndogén (RPLP0 atanapi PPIA) saatos sél LX-2 diinduksi ku TGF-β1 sareng IPA dina média bébas sérum salami 24 jam. A nunjukkeun fibroblast, B nunjukkeun sél apoptotik, C nunjukkeun sél anu salamet, sareng D nunjukkeun éksprési gén dinamika mitokondria. Data dipidangkeun salaku rata-rata ± simpangan baku (SD), n = 3 ékspérimén mandiri. Babandingan statistik dilakukeun nganggo ANOVA hiji arah sareng uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Teras, parobahan ukuran sél (FSC-H) sareng kompleksitas sitoplasma (SSC-H) dipeunteun ku flow cytometry (Gambar 6A, B), sareng parobahan morfologi sél saatos perlakuan IPA dipeunteun ku mikroskop éléktron transmisi (TEM) sareng mikroskop kontras fase (Gambar Tambahan 6A-B). Sapertos anu dipiharep, sél dina kelompok anu dirawat TGF-β1 ningkat ukuranana dibandingkeun sareng kelompok kontrol (Gambar 6A, B), nunjukkeun ékspansi klasik retikulum endoplasma kasar (ER*) sareng fagolisosom (P), nunjukkeun aktivasi sél stém hematopoietik (HSC) (Gambar Tambahan 6A). Nanging, dibandingkeun sareng kelompok anu dirawat TGF-β1, ukuran sél, kompleksitas sitoplasma (Gambar 6A, B), sareng eusi ER* nurun dina kelompok perlakuan kombinasi TGF-β1 sareng IPA (Gambar Tambahan 6A). Salajengna, perlakuan IPA ngirangan ukuran sél, kompleksitas sitoplasma (Gambar 6A, B), eusi P sareng ER* (Gambar Tambahan 6A) dibandingkeun sareng kelompok kontrol. Salian ti éta, eusi sél apoptosis ningkat saatos 24 jam perlakuan IPA dibandingkeun sareng kelompok kontrol (panah bodas, Gambar Tambahan 6B). Sacara koléktif, hasil ieu nunjukkeun yén 1 mM IPA tiasa ngarangsang apoptosis HSC sareng ngabalikeun parobahan dina parameter morfologis sél anu diinduksi ku TGF-β1, ku kituna ngatur ukuran sareng kompleksitas sél, anu tiasa aya hubunganana sareng inaktivasi HSC.
IPA ngarobah ukuran sél sareng kompleksitas sitoplasma dina sél LX-2. Gambar répréséntatif tina analisis sitometri aliran. Analisis ieu nganggo strategi gating khusus pikeun sél LX-2: SSC-A/FSC-A pikeun nangtukeun populasi sél, FSC-H/FSC-A pikeun ngaidentipikasi doublet, sareng SSC-H/FSC-H pikeun analisis ukuran sél sareng kompleksitas. Sél diinkubasi ku TGF-β1 (5 ng/ml) sareng 1 mM IPA dina média bébas sérum salami 24 jam. Sél LX-2 disebarkeun kana kuadran kénca handap (SSC-H-/FSC-H-), kuadran kénca luhur (SSC-H+/FSC-H-), kuadran katuhu handap (SSC-H-/FSC-H+), sareng kuadran katuhu luhur (SSC-H+/FSC-H+) pikeun analisis ukuran sél sareng kompleksitas sitoplasma. B. Morfologi sél dianalisis ku sitometri aliran nganggo FSC-H (sebaran ka hareup, ukuran sél) sareng SSC-H (sebaran sisi, kompleksitas sitoplasma) (30.000 kajadian). Data dipidangkeun salaku rata-rata ± SD, n = 3 ékspérimén mandiri. Babandingan statistik dilakukeun nganggo ANOVA hiji arah sareng uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 sareng ****p < 0,0001
Métabolit peujit sapertos IPA parantos janten topik panalungtikan anu panas, nunjukkeun yén target énggal tiasa kapendak dina mikrobiota peujit. Ku kituna, pikaresepeun yén IPA, metabolit anu parantos kami kaitkeun sareng fibrosis ati dina manusa [15], parantos dipidangkeun janten sanyawa anti-fibrotik poténsial dina modél sato [13, 14]. Di dieu, kami nunjukkeun pikeun kahiji kalina hubungan antara IPA sérum sareng transkriptomik ati global sareng metilasi DNA dina individu obesitas tanpa diabetes tipe 2 (T2D), anu nyorot apoptosis, mitofagi sareng umur panjang, ogé kamungkinan calon gén AKT1 anu ngatur homeostasis ati. Kabaruan anu sanés tina panilitian kami nyaéta kami nunjukkeun interaksi pangobatan IPA sareng apoptosis, morfologi sél, bioenergetika mitokondria sareng dinamika dina sél LX-2, nunjukkeun spéktrum énergi anu langkung handap anu ngarobih fenotipe HSC nuju inaktivasi, ngajantenkeun IPA calon poténsial pikeun ningkatkeun fibrosis ati.
Kami mendakan yén apoptosis, mitofagi sareng umur panjang mangrupikeun jalur kanonik anu paling penting anu diperkaya dina gén ati anu aya hubunganana sareng IPA sérum anu bersirkulasi. Gangguan sistem kontrol kualitas mitokondria (MQC) tiasa nyababkeun disfungsi mitokondria, mitofagi sareng apoptosis, sahingga ngamajukeun kajadian MASLD [33, 34]. Ku alatan éta, urang tiasa ngaduga yén IPA tiasa kalibet dina ngajaga dinamika sél sareng integritas mitokondria ngalangkungan apoptosis, mitofagi sareng umur panjang dina ati. Data kami nunjukkeun yén dua gén umum di tilu uji: YKT6 sareng AKT1. Perlu dicatet yén YKT6 mangrupikeun protéin SNARE anu kalibet dina prosés fusi mémbran sél. Éta maénkeun peran dina autofagi sareng mitofagi ku cara ngabentuk kompleks inisiasi sareng STX17 sareng SNAP29 dina autofagosom, sahingga ngamajukeun fusi autofagosom sareng lisosom [35]. Salajengna, leungitna fungsi YKT6 nyababkeun gangguan mitofagi [36], sedengkeun upregulasi YKT6 aya hubunganana sareng kamajuan karsinoma hepatoselular (HCC), nunjukkeun paningkatan survival sél [37]. Di sisi séjén, AKT1 nyaéta gén anu paling penting anu silih berinteraksi sareng maénkeun peran penting dina panyakit ati, kalebet jalur sinyal PI3K/AKT, siklus sél, migrasi sél, proliferasi, adhesi fokal, fungsi mitokondria, sareng sékrési kolagén [38–40]. Jalur sinyal PI3K/AKT anu diaktipkeun tiasa ngaktipkeun sél stém hematopoietik (HSC), nyaéta sél anu tanggung jawab pikeun produksi matriks ékstrasélulér (ECM), sareng disregulasi na tiasa nyumbang kana kajadian sareng kamajuan fibrosis ati [40]. Salian ti éta, AKT mangrupikeun salah sahiji faktor konci salamet sél anu ngahalangan apoptosis sél anu gumantung kana p53, sareng aktivasi AKT tiasa aya hubunganana sareng inhibisi apoptosis sél ati [41, 42]. Hasil anu diala nunjukkeun yén IPA tiasa kalibet dina apoptosis anu aya hubunganana sareng mitokondria ati ku mangaruhan kaputusan hépatosit antara asup kana apoptosis atanapi salamet. Éfék ieu tiasa diatur ku gén calon AKT sareng/atanapi YKT6, anu penting pikeun homeostasis ati.
Hasil panilitian kami nunjukkeun yén 1 mM IPA ngainduksi apoptosis sareng ngirangan réspirasi mitokondria dina sél LX-2 anu henteu gumantung kana pangobatan TGF-β1. Perlu dicatet yén apoptosis mangrupikeun jalur utama pikeun résolusi fibrosis sareng aktivasi sél stém hematopoietik (HSC), sareng ogé mangrupikeun kajadian konci dina réspon fisiologis fibrosis ati anu tiasa dibalikkeun [4, 43]. Leuwih ti éta, pamulihan BHI dina sél LX-2 saatos pangobatan kombinasi masihan wawasan énggal kana peran poténsial IPA dina pangaturan bioenergetika mitokondria. Dina kaayaan istirahat sareng teu aktip, sél hematopoietik biasana ngamangpaatkeun fosforilasi oksidatif mitokondria pikeun ngahasilkeun ATP sareng gaduh aktivitas métabolik anu handap. Di sisi anu sanés, aktivasi HSC ningkatkeun réspirasi mitokondria sareng biosintésis pikeun ngimbangan paménta énergi pikeun lebet kana kaayaan glikolitik [44]. Kanyataan yén IPA henteu mangaruhan poténsi métabolik sareng ECAR nunjukkeun yén jalur glikolitik kirang diprioritaskeun. Nya kitu, panilitian sanés nunjukkeun yén 1 mM IPA tiasa ngamodulasi aktivitas ranté pernapasan mitokondria dina kardiomiosit, garis sél hepatosit manusa (Huh7) sareng sél endotel véna umbilik manusa (HUVEC); Nanging, teu aya pangaruh IPA anu kapendak kana glikolisis dina kardiomiosit, anu nunjukkeun yén IPA tiasa mangaruhan bioenergetika jinis sél sanés [45]. Ku kituna, urang ngira-ngira yén 1 mM IPA tiasa bertindak salaku uncoupler kimiawi anu hampang, sabab éta tiasa sacara signifikan ngirangan éksprési gén fibrogenik, morfologi sél sareng bioenergetika mitokondria tanpa ngarobih jumlah mtDNA [46]. Uncoupler mitokondria tiasa ngahambat fibrosis anu diinduksi ku kultur sareng aktivasi HSC [47] sareng ngirangan produksi ATP mitokondria anu diatur atanapi diinduksi ku protéin-protéin tertentu sapertos protéin uncoupling (UCP) atanapi adenin nukléotida translocase (ANT). Gumantung kana jinis sél, fénoména ieu tiasa ngajaga sél tina apoptosis sareng / atanapi ngamajukeun apoptosis [46]. Nanging, panilitian salajengna diperyogikeun pikeun ngajelaskeun peran IPA salaku uncoupler mitokondria dina inaktivasi sél stém hematopoietik.
Teras kami nalungtik naha parobahan dina réspirasi mitokondria katingali dina morfologi mitokondria dina sél LX-2 anu hirup. Anu pikaresepeun, pangobatan TGF-β1 ngarobih proporsi mitokondria tina bentuk buleud ka bentuk panengah, kalayan panurunan cabang mitokondria sareng paningkatan éksprési DRP1, faktor konci dina fisi mitokondria [48]. Salajengna, fragmentasi mitokondria aya hubunganana sareng kompleksitas jaringan sacara umum, sareng transisi tina fusi ka fisi penting pisan pikeun aktivasi sél stém hematopoietik (HSC), sedengkeun inhibisi fisi mitokondria nyababkeun apoptosis HSC [49]. Ku kituna, hasil kami nunjukkeun yén pangobatan TGF-β1 tiasa nyababkeun panurunan kompleksitas jaringan mitokondria kalayan panurunan cabang, anu langkung umum dina fisi mitokondria anu aya hubunganana sareng sél stém hematopoietik (HSC) anu diaktipkeun. Salajengna, data kami nunjukkeun yén IPA tiasa ngarobih proporsi mitokondria tina bentuk buleud ka bentuk panengah, sahingga ngirangan éksprési OPA1 sareng MFN2. Panilitian parantos nunjukkeun yén downregulation OPA1 tiasa nyababkeun panurunan poténsi mémbran mitokondria sareng micu apoptosis sél [50]. MFN2 dipikanyaho pikeun ngamediasi fusi mitokondria sareng apoptosis [51]. Hasil anu diala nunjukkeun yén induksi sél LX-2 ku TGF-β1 sareng/atanapi IPA sigana ngamodulasi bentuk sareng ukuran mitokondria, ogé kaayaan aktivasi sareng kompleksitas jaringan.
Hasil panilitian kami nunjukkeun yén pangobatan kombinasi TGFβ-1 sareng IPA tiasa ngirangan mtDNA sareng parameter morfologis sél ku cara ngatur éksprési mRNA fibrosis, apoptosis sareng gén anu aya hubunganana sareng survival dina sél anu nyingkahan apoptosis. Memang, IPA ngirangan tingkat éksprési mRNA AKT1 sareng gén fibrosis anu penting sapertos COL1A2 sareng MMP2, tapi ningkatkeun tingkat éksprési CASP8, anu aya hubunganana sareng apoptosis. Hasil panilitian kami nunjukkeun yén saatos pangobatan IPA, éksprési BAX nurun sareng éksprési mRNA subunit kulawarga TIMP1, BCL-2 sareng NF-κB ningkat, nunjukkeun yén IPA tiasa ngarangsang sinyal survival dina sél stém hematopoietik (HSC) anu nyingkahan apoptosis. Molekul-molekul ieu tiasa bertindak salaku sinyal pro-survival dina sél stém hematopoietik anu diaktipkeun, anu tiasa aya hubunganana sareng ningkatna éksprési protéin anti-apoptosis (sapertos Bcl-2), turunna éksprési BAX pro-apoptosis, sareng interaksi anu kompléks antara TIMP sareng NF-κB [5, 7]. IPA ngalaksanakeun pangaruhna ngaliwatan PXR, sareng kami mendakan yén pangobatan kombinasi sareng TGF-β1 sareng IPA ningkatkeun tingkat éksprési mRNA PXR, nunjukkeun panurunan aktivasi HSC. Sinyal PXR anu diaktipkeun dipikanyaho ngahambat aktivasi HSC boh in vivo sareng in vitro [52, 53]. Hasil kami nunjukkeun yén IPA tiasa ilubiung dina beberesih HSC anu diaktipkeun ku cara ningkatkeun apoptosis, ngirangan fibrosis sareng métabolisme mitokondria, sareng ningkatkeun sinyal survival, anu mangrupikeun prosés khas anu ngarobih fenotipe HSC anu diaktipkeun janten anu teu diaktipkeun. Panjelasan anu sanés pikeun mékanisme poténsial sareng peran IPA dina apoptosis nyaéta ngabersihkeun mitokondria disfungsional utamina ngalangkungan mitofagi (jalur intrinsik) sareng jalur sinyal TNF ékstrinsik (Tabel 1), anu langsung aya hubunganana sareng jalur sinyal survival NF-κB (Gambar Tambahan 7). Anu pikaresepeun, gén anu diperkaya anu aya hubunganana sareng IPA tiasa ngainduksi sinyal pro-apoptosis sareng pro-survival dina jalur apoptosis [54], nunjukkeun yén IPA tiasa ngainduksi jalur apoptosis atanapi survival ku cara berinteraksi sareng gén ieu. Nanging, kumaha IPA ngainduksi apoptosis atanapi survival salami aktivasi HSC sareng jalur mékanistikna masih teu jelas.
IPA nyaéta metabolit mikroba anu kabentuk tina triptofan dahareun ngaliwatan mikrobiota peujit. Panilitian nunjukkeun yén éta ngagaduhan sipat anti radang, antioksidan, sareng pangaturan epigenetik dina lingkungan peujit.[55] Panilitian nunjukkeun yén IPA tiasa ngamodulasi fungsi panghalang peujit sareng ngirangan setrés oksidatif, anu tiasa nyumbang kana épék fisiologis lokalna.[56] Nyatana, IPA diangkut ka organ target ngaliwatan sirkulasi, sareng kumargi IPA ngabagi struktur metabolit utama anu sami sareng triptofan, serotonin, sareng turunan indol, IPA ngalaksanakeun tindakan métabolik anu ngahasilkeun nasib métabolik anu kompetitif.[52] IPA tiasa bersaing sareng metabolit anu diturunkeun tina triptofan pikeun situs ngabeungkeut dina énzim atanapi reséptor, anu berpotensi ngaganggu jalur métabolik normal. Ieu nyorot kabutuhan panilitian salajengna ngeunaan farmakokinetik sareng farmakodinamikna pikeun langkung ngartos jandela terapi na.[57] Tetep kedah ditingali naha ieu ogé tiasa kajantenan dina sél stém hématopoietik (HSC).
Kami ngaku yén panilitian kami ngagaduhan sababaraha watesan. Pikeun sacara khusus nalungtik hubungan anu aya hubunganana sareng IPA, kami ngaluarkeun pasien anu ngagaduhan diabetes mellitus tipe 2 (T2DM). Kami ngaku yén ieu ngawatesan aplikasi anu lega tina panemuan kami pikeun pasien anu ngagaduhan diabetes mellitus tipe 2 sareng panyakit ati lanjut. Sanaos konsentrasi fisiologis IPA dina sérum manusa nyaéta 1-10 μM [11, 20], konsentrasi 1 mM IPA dipilih dumasar kana konsentrasi non-toksik pangluhurna [15] sareng tingkat apoptosis pangluhurna, tanpa bédana dina persentase populasi sél nekrotik. Sanaos tingkat suprafisiologis IPA dianggo dina panilitian ieu, ayeuna teu aya konsensus ngeunaan dosis efektif IPA [52]. Sanaos hasil kami signifikan, nasib métabolik IPA anu langkung lega tetep janten daérah panilitian anu aktip. Leuwih ti éta, panemuan kami ngeunaan hubungan antara tingkat sérum IPA sareng metilasi DNA tina transkrip ati henteu ngan ukur diala tina sél stém hematopoietik (HSC) tapi ogé tina jaringan ati. Kami milih ngagunakeun sél LX-2 manusa dumasar kana panemuan kami sateuacanna tina analisis transkriptom yén IPA aya hubunganana sareng aktivasi sél stém hematopoietik (HSC) [15], sareng HSC mangrupikeun sél utama anu kalibet dina kamajuan fibrosis ati. Ati diwangun ku sababaraha jinis sél, janten modél sél sanés sapertos sistem ko-kultur sél imun hepatosit-HSC anu digabungkeun sareng aktivasi caspase sareng fragmentasi DNA ogé mékanisme aksi kalebet tingkat protéin kedah dipertimbangkeun pikeun nalungtik peran IPA sareng interaksina sareng jinis sél ati anu sanés.