Téori pertahanan tutuwuhan anu béda-béda nyayogikeun pituduh téoritis anu penting pikeun ngajelaskeun pola métabolisme khusus tutuwuhan, tapi prediksi konci na masih kedah diuji. Di dieu, urang nganggo analisis spéktrométri massa tandem (MS/MS) anu teu bias pikeun sacara sistematis ngajalajah métabolom galur bako anu dilemahkeun tina pepelakan individu ka populasi sareng spésiés anu raket patalina, sareng ngolah sajumlah ageung téori fitur spéktrométri massa dumasar kana spéktra sanyawa dina inpormasi. Kerangka pikeun nguji prediksi konci téori pertahanan optimal (OD) sareng target anu bergerak (MT). Komponén inpormasi métabolom tutuwuhan saluyu sareng téori OD, tapi bertentangan sareng prediksi utama téori MT ngeunaan dinamika métabolom anu disababkeun ku herbivora. Tina skala évolusi mikro dugi ka makro, sinyal jasmonat diidentifikasi salaku penentu utama OD, sedengkeun sinyal étiléna nyayogikeun panyesuaian réspon spésifik herbivora anu dianotasi ku jaringan molekuler MS/MS.
Métabolit husus kalayan struktur anu rupa-rupa mangrupikeun pamilon utama dina adaptasi tutuwuhan kana lingkungan, khususna dina pertahanan musuh (1). Diversifikasi anu luar biasa tina métabolisme khusus anu aya dina tutuwuhan parantos ngarangsang panilitian anu jero salami sababaraha dasawarsa ngeunaan seueur aspék fungsi ékologisna, sareng parantos ngabentuk daptar panjang téori pertahanan tutuwuhan, nyaéta kamekaran évolusionér sareng ékologis tina interaksi tutuwuhan-serangga. Panilitian empiris nyayogikeun pituduh penting (2). Nanging, téori pertahanan tutuwuhan ieu henteu nuturkeun jalur normatif tina penalaran deduktif hipotétis, dimana prediksi konci aya dina tingkat analisis anu sami (3) sareng diuji sacara ékspériméntal pikeun ngamajukeun siklus kamekaran téoritis salajengna (4). Watesan téknis ngawatesan pangumpulan data kana kategori métabolik khusus sareng ngaluarkeun analisis komprehensif ngeunaan métabolik khusus, sahingga nyegah babandingan antar kategori anu penting pikeun kamekaran téoritis (5). Kurangna data métabolik anu komprehensif sareng mata uang umum pikeun ngabandingkeun alur kerja pamrosésan rohangan métabolik antara kelompok tutuwuhan anu béda ngahalangan kematangan ilmiah widang éta.
Kamajuan panganyarna dina widang metabolomik spéktrométri massa tandem (MS/MS) tiasa sacara komprehensif ngacirikeun parobahan métabolik dina sareng antara spésiés tina klad sistem anu dipasihkeun, sareng tiasa digabungkeun sareng metode komputasi pikeun ngitung kamiripan struktural antara campuran kompléks ieu. Pangaweruh kimia sateuacanna (5). Kombinasi téknologi canggih dina analisis sareng komputasi nyayogikeun kerangka anu diperyogikeun pikeun uji jangka panjang tina seueur prediksi anu dilakukeun ku téori ékologis sareng évolusionér ngeunaan karagaman métabolik. Shannon (6) ngenalkeun téori informasi pikeun kahiji kalina dina artikel seminalna dina taun 1948, neundeun pondasi pikeun analisis matematis inpormasi, anu parantos dianggo dina seueur widang salian ti aplikasi aslina. Dina génomik, téori informasi parantos suksés diterapkeun pikeun ngitung inpormasi konservatif runtuyan (7). Dina panalungtikan transkriptomik, téori informasi nganalisis parobahan sakabéhna dina transkriptomik (8). Dina panalungtikan sateuacana, kami nerapkeun kerangka statistik téori informasi kana metabolomik pikeun ngajelaskeun kaahlian métabolik tingkat jaringan dina pepelakan (9). Di dieu, urang ngagabungkeun alur kerja berbasis MS/MS sareng kerangka statistik téori informasi, anu dicirikeun ku karagaman métabolik dina mata uang umum, pikeun ngabandingkeun prediksi konci téori pertahanan tutuwuhan tina métabolom anu diinduksi ku herbivora.
Kerangka téoritis pertahanan tutuwuhan biasana silih inklusif sareng tiasa dibagi kana dua kategori: anu nyobian ngajelaskeun distribusi metabolit spésifik tutuwuhan dumasar kana fungsi pertahanan, sapertos pertahanan optimal (OD) (10), target anu bergerak (MT) (11)) Sareng téori penampilan (12), sedengkeun anu sanésna milarian katerangan mékanis ngeunaan kumaha parobahan dina kasadiaan sumber daya mangaruhan kamekaran pepelakan sareng akumulasi metabolit khusus, sapertos karbon: hipotesis kasaimbangan nutrisi (13), hipotesis laju pertumbuhan (14), sareng hipotesis kasaimbangan pertumbuhan sareng diferensiasi (15). Dua sét téori aya dina tingkat analisis anu béda (4). Nanging, dua téori anu ngalibatkeun fungsi pertahanan dina tingkat fungsional ngadominasi paguneman ngeunaan pertahanan konstitutif sareng anu tiasa diinduksi pepelakan: téori OD, anu nganggap yén pepelakan investasi dina pertahanan kimia anu mahal ngan ukur nalika diperyogikeun, contona, nalika aranjeunna dicerna. Nalika sato jukut nyerang, ku kituna, numutkeun kamungkinan serangan ka hareup, sanyawa kalayan fungsi pertahanan ditugaskeun (10); Hipotesis MT ngajukeun yén teu aya sumbu parobahan metabolit arah, tapi metabolitna robah sacara acak, sahingga nyiptakeun kamungkinan Ngahalangan "target gerakan" métabolik tina herbivora anu nyerang. Kalayan kecap sanésna, dua téori ieu ngadamel prediksi anu sabalikna ngeunaan remodeling métabolik anu lumangsung saatos serangan herbivora: hubungan antara akumulasi metabolit uniarah kalayan fungsi pertahanan (OD) sareng parobahan métabolik anu teu diarahkeun (MT) (11).
Hipotesis OD sareng MT henteu ngan ukur ngalibetkeun parobahan anu diinduksi dina métabolom, tapi ogé akibat ékologis sareng évolusionér tina akumulasi metabolit ieu, sapertos biaya adaptif sareng kauntungan tina parobahan métabolik ieu dina lingkungan ékologis anu khusus (16). Sanaos duanana hipotesis ngakuan fungsi pertahanan metabolit khusus, anu tiasa mahal atanapi henteu, prediksi konci anu ngabédakeun hipotesis OD sareng MT aya dina arah parobahan métabolik anu diinduksi. Prediksi téori OD parantos nampi perhatian ékspériméntal anu paling seueur dugi ka ayeuna. Tés ieu kalebet ulikan ngeunaan fungsi pertahanan langsung atanapi teu langsung tina jaringan anu béda tina sanyawa khusus di rumah kaca sareng kaayaan alam, ogé parobahan dina tahapan kamekaran pepelakan (17-19). Nanging, dugi ka ayeuna, kusabab kurangna alur kerja sareng kerangka statistik pikeun analisis komprehensif global ngeunaan karagaman métabolik organisme naon waé, prediksi bédana utama antara dua téori (nyaéta, arah parobahan métabolik) masih kedah diuji. Di dieu, kami nyayogikeun analisis sapertos kitu.
Salah sahiji ciri anu paling penting tina metabolit spésifik tutuwuhan nyaéta karagaman struktural anu ekstrim dina sadaya tingkatan ti pepelakan tunggal, populasi dugi ka spésiés anu sami (20). Seueur parobahan kuantitatif dina metabolit khusus tiasa dititénan dina skala populasi, sedengkeun béda kualitatif anu kuat biasana dijaga dina tingkat spésiés (20). Ku alatan éta, karagaman métabolik tutuwuhan mangrupikeun aspék utama tina karagaman fungsional, anu ngagambarkeun adaptasi kana relung anu béda, khususna relung anu gaduh kamungkinan invasi anu béda ku serangga khusus sareng herbivora umum (21). Kusabab artikel Fraenkel (22) anu inovatif ngeunaan alesan ayana metabolit spésifik tutuwuhan, interaksi sareng rupa-rupa serangga parantos dianggap salaku tekanan seleksi anu penting, sareng interaksi ieu dipercaya parantos ngabentuk pepelakan salami évolusi. Jalur métabolik (23). Béda antar spésiés dina karagaman metabolit khusus ogé tiasa ngagambarkeun kasaimbangan fisiologis anu aya hubunganana sareng pertahanan pepelakan konstitutif sareng anu tiasa diinduksi ngalawan strategi herbivora, sabab dua spésiés ieu sering berkorelasi négatif sareng silih (24). Sanaos tiasa mangpaat pikeun ngajaga pertahanan anu saé sepanjang waktos, parobahan métabolik anu pas waktuna anu aya hubunganana sareng pertahanan nyayogikeun kauntungan anu jelas dina ngamungkinkeun pepelakan pikeun ngalokasikeun sumber daya anu berharga pikeun investasi fisiologis anu sanés (19, 24), sareng nyingkahan kabutuhan simbiosis. Karusakan jaminan (25). Salaku tambahan, reorganisasi metabolit khusus anu disababkeun ku herbivora serangga ieu tiasa nyababkeun distribusi anu ngancurkeun dina populasi (26), sareng tiasa ngagambarkeun bacaan langsung tina parobahan alami anu penting dina sinyal asam jasmonat (JA), anu tiasa dijaga dina populasi. Sinyal JA anu luhur sareng handap mangrupikeun trade-off antara pertahanan ngalawan herbivora sareng persaingan sareng spésiés khusus (27). Salaku tambahan, jalur biosintésis metabolit khusus bakal ngalaman karugian sareng transformasi anu gancang salami évolusi, anu ngahasilkeun distribusi métabolik anu henteu rata di antara spésiés anu raket patalina (28). Polimorfisme ieu tiasa gancang ditetepkeun salaku réspon kana pola herbivora anu robih (29), anu hartosna yén fluktuasi komunitas herbivora mangrupikeun faktor konci anu ngadorong hétérogénitas métabolik.
Di dieu, urang sacara khusus ngarengsekeun masalah-masalah ieu. (I) Kumaha serangga herbivora ngonpigurasikeun deui métabolom tutuwuhan? (Ii) Naon komponén informasi utama tina plastisitas métabolik anu tiasa diukur pikeun nguji prediksi téori pertahanan jangka panjang? (Iii) Naha kedah ngaprogram deui métabolom tutuwuhan ku cara anu unik pikeun panyerang, upami kitu, naon peran hormon tutuwuhan dina nyaluyukeun réspon métabolik anu khusus, sareng métabolit mana anu nyumbang kana spésifisitas spésiés pertahanan? (Iv) Kusabab prediksi anu dilakukeun ku seueur téori pertahanan tiasa diperpanjang di sadaya tingkat jaringan biologis, urang naroskeun sabaraha konsisten réspon métabolik anu disababkeun tina babandingan internal ka babandingan antarspésiés? Pikeun tujuan ieu, urang sacara sistematis parantos nalungtik metabolit daun nikotin bako, nyaéta pepelakan modél ékologis kalayan métabolisme khusus anu beunghar, sareng efektif ngalawan larva dua herbivora asli, Lepidoptera Datura (Ms) (Agrésif pisan, utamina didahar) Dina Solanaceae sareng Spodoptera littoralis (Sl), cacing daun kapas mangrupikeun jinis "genus", kalayan pepelakan inang Solanaceae sareng inang sanés tina genera sareng kulawarga sanés. Kadaharan pepelakan. Kami nganalisis spéktrum metabolomik MS/MS sareng ngekstrak déskriptor statistik téori inpormasi pikeun ngabandingkeun téori OD sareng MT. Jieun peta spésifisitas pikeun ngungkabkeun idéntitas metabolit konci. Analisis ieu diperpanjang ka populasi asli N. nasi sareng spésiés bako anu raket patalina pikeun nganalisis langkung lanjut kovarian antara sinyalisasi hormon pepelakan sareng induksi OD.
Pikeun néwak peta sakabéhna ngeunaan plastisitas sareng struktur métabolom daun bako herbivora, kami nganggo alur kerja analisis sareng itungan anu parantos dikembangkeun sateuacanna pikeun ngumpulkeun sacara komprehensif sareng ngadekonvolusi spéktra MS/MS anu mandiri tina data résolusi tinggi tina ekstrak pepelakan (9). Métode anu teu dibédakeun ieu (disebut MS/MS) tiasa ngawangun spéktra sanyawa anu henteu redundan, anu teras tiasa dianggo pikeun sadaya analisis tingkat sanyawa anu dijelaskeun di dieu. Métabolit pepelakan anu didekonvolusi ieu rupa-rupa jinisna, diwangun ku ratusan dugi ka rébuan métabolit (sakitar 500-1000-s/MS/MS di dieu). Di dieu, kami mertimbangkeun plastisitas métabolik dina kerangka téori inpormasi, sareng ngitung karagaman sareng profesionalisme métabolom dumasar kana éntropi Shannon tina distribusi frékuénsi métabolik. Nganggo rumus anu parantos dilaksanakeun sateuacanna (8), kami ngitung sakumpulan indikator anu tiasa dianggo pikeun ngitung karagaman métabolom (indikator Hj), spésialisasi profil métabolik (indikator δj) sareng spésifisitas métabolik hiji métabolit (indikator Si). Salian ti éta, urang nerapkeun Indéks Plastisitas Jarak Relatif (RDPI) pikeun ngitung induktibilitas métabolom herbivora (Gambar 1A) (30). Dina kerangka statistik ieu, urang nganggap spéktrum MS/MS salaku unit informasi dasar, sareng ngolah kaayaanana relatif MS/MS kana peta distribusi frékuénsi, teras nganggo éntropi Shannon pikeun ngira-ngira karagaman métabolom ti dinya. Spésialisasi métabolom diukur ku spésifisitas rata-rata spéktrum MS/MS tunggal. Ku alatan éta, paningkatan kaayaanana sababaraha kelas MS/MS saatos induksi herbivora dirobih jadi induktibilitas spéktral, RDPI sareng spésialisasi, nyaéta, paningkatan indéks δj, sabab metabolit anu langkung khusus dihasilkeun sareng indéks Si anu luhur dihasilkeun. Panurunan indéks karagaman Hj ngagambarkeun yén boh jumlah MS/MS anu dihasilkeun dikirangan, atanapi distribusi frékuénsi profil robih dina arah anu kirang seragam, bari ngirangan kateupastian sacara umum. Ngaliwatan itungan indéks Si, tiasa diungkabkeun MS/MS mana anu diinduksi ku herbivora tertentu, sabalikna, MS/MS mana anu henteu ngaréspon kana induksi, anu mangrupikeun indikator konci pikeun ngabédakeun prediksi MT sareng OD.
(A) Deskriptor statistik anu dianggo pikeun MS/MS herbivora (H1 ka Hx) data-inducibility (RDPI), diversity (indéks Hj), spésialisasi (indéks δj) sareng spésifisitas metabolit (indéks Si). Kanaékan dina tingkat spésialisasi (δj) nunjukkeun yén, rata-rata, langkung seueur metabolit spésifik herbivora anu bakal dihasilkeun, sedengkeun panurunan dina diversity (Hj) nunjukkeun panurunan dina produksi metabolit atanapi distribusi metabolit anu henteu rata dina peta distribusi. Nilai Si meunteun naha metabolit spésifik pikeun kaayaan anu dipasihkeun (di dieu, herbivora) atanapi sabalikna dijaga dina tingkat anu sami. (B) Diagram konseptual prediksi téori pertahanan nganggo sumbu téori informasi. Téori OD ngaduga yén serangan herbivora bakal ningkatkeun metabolit pertahanan, sahingga ningkatkeun δj. Dina waktos anu sami, Hj nurun sabab profilna diatur deui nuju kateupastian inpormasi métabolik anu dikirangan. Téori MT ngaduga yén serangan herbivora bakal nyababkeun parobahan non-arah dina métabolom, sahingga ningkatkeun Hj salaku indikator ningkatna kateupastian informasi métabolik sareng nyababkeun distribusi acak Si. Kami ogé ngajukeun modél campuran, MT pangsaéna, dimana sababaraha metabolit kalayan nilai pertahanan anu langkung luhur bakal ningkat sacara khusus (nilai Si anu luhur), sedengkeun anu sanésna nunjukkeun réspon acak (nilai Si anu langkung handap).
Ngagunakeun déskriptor téori informasi, urang napsirkeun téori OD pikeun ngaduga yén parobahan metabolit khusus anu diinduksi ku herbivora dina kaayaan konstitutif anu teu diinduksi bakal nyababkeun (i) paningkatan spésifisitas métabolik (indéks Si) anu ngadorong spésifisitas métabolik (indéks δj). Kanaékan) gugus metabolit khusus anu tangtu kalayan nilai pertahanan anu langkung luhur, sareng (ii) panurunan karagaman métabolom (indéks Hj) kusabab parobahan distribusi frékuénsi métabolik ka distribusi awak leptin anu langkung seueur. Dina tingkat hiji metabolit, distribusi Si anu teratur dipiharep, dimana metabolit bakal ningkatkeun nilai Si numutkeun nilai pertahananana (Gambar 1B). Sapanjang garis ieu, urang ngajelaskeun téori MT pikeun ngaduga yén éksitasi bakal nyababkeun (i) parobahan non-arah dina metabolit anu nyababkeun panurunan indéks δj, sareng (ii) paningkatan indéks Hj kusabab paningkatan kateupastian métabolik. Atawa randomness, anu tiasa diukur ku entropi Shannon dina bentuk karagaman umum. Sedengkeun pikeun komposisi métabolik, téori MT bakal ngaduga distribusi acak Si. Kalayan merhatoskeun yén métabolit-métabolit anu tangtu aya dina kaayaan anu khusus dina kaayaan anu khusus, sareng kaayaan anu sanés henteu dina kaayaan anu khusus, sareng nilai pertahananana gumantung kana lingkungan, kami ogé ngajukeun modél pertahanan campuran, dimana δj sareng Hj disebarkeun dina dua sapanjang Si. Kanaékan ka sadaya arah, ngan ukur gugus métabolit anu tangtu, anu gaduh nilai pertahanan anu langkung luhur, anu bakal ningkatkeun Si sacara khusus, sedengkeun anu sanésna bakal gaduh distribusi acak (Gambar 1B).
Pikeun nguji prediksi téori pertahanan anu didefinisikeun deui dina sumbu déskriptor téori informasi, kami ngangkat larva herbivora ahli (Ms) atanapi generalis (Sl) dina daun Nepenthes pallens (Gambar 2A). Ngagunakeun analisis MS/MS, kami ngajemput 599 spéktra MS/MS anu henteu redundan (file data S1) tina ekstrak metanol jaringan daun anu dikumpulkeun saatos tuang ulat. Ngagunakeun indéks RDPI, Hj, sareng δj pikeun ngabayangkeun konfigurasi ulang eusi inpormasi dina file konfigurasi MS/MS ngungkabkeun pola anu pikaresepeun (Gambar 2B). Tren sacara umum nyaéta, sakumaha anu dijelaskeun ku déskriptor informasi, nalika ulat terus tuang daun, tingkat sadaya reorganisasi métabolik ningkat kana waktosna: 72 jam saatos herbivora tuang, RDPI ningkat sacara signifikan. Dibandingkeun sareng kontrol anu henteu ruksak, Hj turun sacara signifikan, anu disababkeun ku ningkatna tingkat spésialisasi profil métabolik, anu diukur ku indéks δj. Tren anu katingali ieu saluyu sareng prediksi téori OD, tapi henteu saluyu sareng prediksi utama téori MT, anu percaya yén parobahan acak (non-arah) dina tingkat metabolit dianggo salaku kamuflase pertahanan (Gambar 1B). Sanaos eusi élisitor sékrési oral (OS) sareng paripolah tuang dua herbivora ieu béda, tuang langsungna nyababkeun parobahan anu sami dina arah Hj sareng δj salami période panén 24 jam sareng 72 jam. Hiji-hijina bédana kajantenan dina 72 jam RDPI. Dibandingkeun sareng anu disababkeun ku tuang Ms, métabolisme sakabéhna anu diinduksi ku tuang Sl langkung luhur.
(A) Desain ékspériméntal: herbivora babi biasa (S1) atanapi ahli (Ms) dibéré dahar daun pepelakan kantong semar anu didésalinasi, sedengkeun pikeun herbivora simulasi, OS Ms (W + OSM) dianggo pikeun nanganan tusukan posisi daun standar anu tatu. S1 (W + OSSl) larva atanapi cai (W + W). Kontrol (C) nyaéta daun anu teu ruksak. (B) Inducibility (RDPI dibandingkeun sareng bagan kontrol), diversity (indéks Hj) sareng spésialisasi (indéks δj) indéks anu diitung pikeun peta metabolit khusus (599 MS/MS; file data S1). Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan antara tuangeun herbivora langsung sareng grup kontrol (uji-t Student kalayan uji-t anu dipasangkeun, *P<0,05 sareng ***P<0,001). ns, teu penting. (C) Indéks résolusi waktos tina spéktrum utama (kotak biru, asam amino, asam organik sareng gula; file data S2) sareng spéktrum metabolit khusus (kotak beureum 443 MS/MS; file data S1) saatos simulasi perlakuan herbivora. Pita warna nuduhkeun interval kapercayaan 95%. Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan antara perlakuan sareng kontrol [analisis varian kuadrat (ANOVA), dituturkeun ku béda anu signifikan sacara jujur ​​​​Tukey (HSD) pikeun sababaraha babandingan post hoc, *P<0,05, **P<0,01 Sareng *** P <0,001]. (D) Spésialisasi plot sebar sareng profil metabolit khusus (sampel anu diulang kalayan perlakuan anu béda).
Pikeun nalungtik naha remodeling anu diinduksi ku herbivora dina tingkat métabolom kacerminkan dina parobahan tingkat metabolit individu, mimitina urang fokus kana metabolit anu sateuacanna ditalungtik dina daun Nepenthes pallens kalayan résistansi herbivora anu kabuktian. Amida fenolik nyaéta konjugat hidroksisinamamide-poliamina anu akumulasi salami prosés herbivora serangga sareng dipikanyaho ngirangan kinerja serangga (32). Urang milarian prékursor MS/MS anu saluyu sareng ngaplot kurva kinétik kumulatifna (Gambar S1). Teu anéh, turunan fenol anu henteu langsung kalibet dina pertahanan ngalawan herbivora, sapertos asam klorogénik (CGA) sareng rutin, turun saatos herbivora. Sabalikna, herbivora tiasa ngajantenkeun fenol amida janten kuat pisan. Dahar anu terus-terusan tina dua herbivora nyababkeun spéktrum éksitasi fenolamida anu ampir sami, sareng pola ieu khususna atra pikeun sintésis fenolamida de novo. Fenomena anu sami bakal katingali nalika ngajalajah jalur 17-hydroxygeranyl nonanediol diterpene glycosides (17-HGL-DTGs), anu ngahasilkeun sajumlah ageung diterpenes asiklik kalayan fungsi anti-herbivora anu efektif (33), anu Ms Feeding sareng Sl micu profil éksprési anu sami (Gambar S1)).
Kakurangan anu mungkin tina ékspérimén tuang herbivora langsung nyaéta bédana dina laju konsumsi daun sareng waktos tuang herbivora, anu ngajantenkeun hésé pikeun ngaleungitkeun épék spésifik herbivora anu disababkeun ku tatu sareng herbivora. Pikeun ngarengsekeun spésifisitas spésiés herbivora tina réspon métabolik daun anu diinduksi, kami nyimulasikeun tuang larva Ms sareng Sl ku cara langsung nerapkeun OS anu nembé dikumpulkeun (OSM sareng OSS1) kana tusukan standar W tina posisi daun anu konsisten. Prosedur ieu disebut perlakuan W + OS, sareng éta ngastandarisasi induksi ku cara tepatna waktos awal réspon anu ditimbulkeun ku herbivora tanpa nyababkeun épék ngabingungkeun tina bédana dina laju atanapi kuantitas leungitna jaringan (Gambar 2A) (34). Ngagunakeun analisis MS/MS sareng pipa itungan, kami kéngingkeun 443 spéktra MS/MS (file data S1), anu tumpang tindih sareng spéktra anu sateuacanna dirakit tina ékspérimén tuang langsung. Analisis téori inpormasi tina set data MS/MS ieu nunjukkeun yén pamrograman ulang métabolom khusus daun ku cara nyimulasikeun herbivora nunjukkeun induksi spésifik OS (Gambar 2C). Utamana, dibandingkeun sareng perlakuan OSS1, OSM nyababkeun paningkatan spésialisasi métabolom dina 4 jam. Perlu dicatet yén dibandingkeun sareng set data ékspériméntal anu langsung nyoco herbivora, kinétika métabolom anu divisualisasikeun dina rohangan dua diménsi nganggo Hj sareng δj salaku koordinat sareng arah spésialisasi métabolom dina réspon kana perlakuan herbivora simulasi kana waktosna Ningkat konsisten (Gambar 2D). Dina waktos anu sami, urang ngitung eusi asam amino, asam organik sareng gula (file data S2) pikeun nalungtik naha paningkatan anu dituju dina kaahlian métabolom ieu disababkeun ku konfigurasi ulang métabolisme karbon pusat dina réspon kana herbivora simulasi (Gambar S2). Pikeun ngajelaskeun pola ieu langkung saé, urang langkung ngawas kinétika akumulasi métabolom tina jalur fenolamida sareng 17-HGL-DTG anu parantos dibahas sateuacanna. Induksi herbivora khusus OS dirobih janten pola pangaturan ulang diferensial dina métabolisme fenolamida (Gambar S3). Amida fenolik anu ngandung gugus kumarin sareng kafein langkung dipikaresep diinduksi ku OSS1, sedengkeun OSM micu induksi khusus konjugat ferulil. Pikeun jalur 17-HGL-DTG, induksi OS diferensial ku produk malonilasi sareng dimalonilasi hilir dideteksi (Gambar S3).
Salajengna, urang nalungtik plastisitas transkriptom anu diinduksi OS nganggo set data microarray time-course, anu ngasimulasikeun panggunaan OSM pikeun ngubaran daun daun tutuwuhan roset dina herbivora. Kinétika sampling dasarna tumpang tindih sareng kinétika anu dianggo dina studi metabolomik ieu (35). Dibandingkeun sareng konfigurasi ulang metabolom dimana plastisitas métabolik ningkat sacara khusus kana waktosna, urang niténan burst transkripsi transien dina daun anu diinduksi ku Ms, dimana indukbilitas transkriptom (RDPI) sareng spesialisasi (δj) aya dina 1 Aya paningkatan anu signifikan dina jam, sareng karagaman (Hj) dina waktos ieu, éksprési BMP1 dikirangan sacara signifikan, dituturkeun ku rélaksasi spesialisasi transkriptom (Gambar S4). Kulawarga gén métabolik (sapertos P450, glikosiltransferase, sareng BAHD asiltransferase) ilubiung dina prosés ngumpulkeun metabolit khusus tina unit struktural anu diturunkeun tina métabolisme primér, nuturkeun modél spesialisasi tinggi awal anu kasebat di luhur. Salaku studi kasus, jalur fenilalanin dianalisis. Analisis ieu mastikeun yén gén inti dina métabolisme fenolamida diinduksi OS pisan dina herbivora dibandingkeun sareng pepelakan anu teu katarik, sareng raket pisan dina pola éksprési na. Faktor transkripsi MYB8 sareng gén struktural PAL1, PAL2, C4H sareng 4CL di hulu jalur ieu nunjukkeun inisiasi transkripsi awal. Asiltransferase anu maénkeun peran dina perakitan ahir fenolamida, sapertos AT1, DH29, sareng CV86, nunjukkeun pola upregulasi anu berkepanjangan (Gambar S4). Observasi di luhur nunjukkeun yén inisiasi awal spesialisasi transkriptom sareng paningkatan spesialisasi metabolomik anu langkung engké mangrupikeun modeu gandeng, anu tiasa disababkeun ku sistem pangaturan sinkron anu ngamimitian réspon pertahanan anu kuat.
Konfigurasi ulang dina sinyal hormon tutuwuhan bertindak salaku lapisan pangaturan anu ngahijikeun inpormasi herbivora pikeun ngaprogram ulang fisiologi tutuwuhan. Saatos simulasi herbivora, urang ngukur dinamika kumulatif kategori hormon tutuwuhan konci sareng ngavisualisasikeun ko-éksprési temporal di antara aranjeunna [koéfisién korélasi Pearson (PCC)> 0.4] (Gambar 3A). Sapertos anu dipiharep, hormon tutuwuhan anu aya hubunganana sareng biosintésis dihubungkeun dina jaringan ko-éksprési hormon tutuwuhan. Salaku tambahan, spésifisitas métabolik (indéks Si) dipetakan kana jaringan ieu pikeun nyorot hormon tutuwuhan anu diinduksi ku perlakuan anu béda. Dua daérah utama réspon spésifik herbivora digambarkeun: hiji aya dina klaster JA, dimana JA (bentuk biologis aktif JA-Ile) sareng turunan JA sanésna nunjukkeun skor Si pangluhurna; anu sanésna nyaéta étilén (ET). Giberelin ngan ukur nunjukkeun paningkatan sedeng dina spésifisitas herbivora, sedengkeun hormon tutuwuhan sanés, sapertos sitokinin, auksin, sareng asam absisat, ngagaduhan spésifisitas induksi anu handap pikeun herbivora. Dibandingkeun sareng nganggo W + W nyalira, amplifikasi nilai puncak turunan JA ngalangkungan aplikasi OS (W + OS) sacara dasarna tiasa dirobih janten indikator spésifik anu kuat pikeun JA. Tanpa disangka-sangka, OSM sareng OSS1 kalayan eusi elisitor anu béda dipikanyaho nyababkeun akumulasi JA sareng JA-Ile anu sami. Sabalikna sareng OSS1, OSM diinduksi sacara spésifik sareng kuat ku OSM, sedengkeun OSS1 henteu ngagedekeun réspon tatu basal (Gambar 3B).
(A) Analisis jaringan ko-éksprési dumasar kana itungan PCC tina simulasi kinétika akumulasi hormon tutuwuhan anu diinduksi ku herbivora. Node ngawakilan hiji hormon tutuwuhan, sareng ukuran node ngawakilan indéks Si khusus pikeun hormon tutuwuhan antara perlakuan. (B) Akumulasi JA, JA-Ile sareng ET dina daun anu disababkeun ku perlakuan anu béda anu dituduhkeun ku warna anu béda: aprikot, W + OSM; biru, W + OSSl; hideung, W + W; kulawu, C (kontrol). Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan antara perlakuan sareng kontrol (ANOVA dua arah dituturkeun ku Tukey HSD post hoc multiple comparison, *** P <0,001). Analisis téori informasi (C)697 MS/MS (file data S1) dina biosintésis JA sareng spéktrum persépsi anu kaganggu (irAOC sareng irCOI1) sareng (D)585 MS/MS (file data S1) dina ETR1 kalayan sinyal ET anu kaganggu Dua perlakuan herbivora simulasi micu garis tutuwuhan sareng pabrik kontrol kendaraan kosong (EV). Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan antara perlakuan W+OS sareng kontrol anu teu ruksak (ANOVA dua arah dituturkeun ku Tukey HSD post hoc multiple comparison, *P<0.05, **P<0.01 sareng ***P<0.001). (E) Grafik anu sumebar tina oposisi anu sumebar kana spésialisasi. Warna-warna ngagambarkeun galur anu dirobih sacara genetik anu béda; simbol ngagambarkeun metode perlakuan anu béda: segitiga, W + OSS1; pasagi panjang, W + OSM; bunderan C
Salajengna, urang nganggo galur Nepenthes anu dilemahkeun sacara genetik (irCOI1 sareng sETR1) dina léngkah konci biosintésis JA sareng ET (irAOC sareng irACO) sareng persépsi (irCOI1 sareng sETR1) pikeun nganalisis métabolisme dua hormon tutuwuhan ieu dina herbivora. Kontribusi relatif tina reprogramming. Saluyu sareng ékspérimén sateuacana, urang mastikeun induksi herbivora-OS dina tutuwuhan pamawa kosong (EV) (Gambar 3, C dugi ka D) sareng panurunan sacara umum dina indéks Hj anu disababkeun ku OSM, sedengkeun indéks δj ningkat. Réspon langkung jelas tibatan réspon anu dipicu ku OSS1. Grafik dua garis anu nganggo Hj sareng δj salaku koordinat nunjukkeun deregulasi spésifik (Gambar 3E). Tren anu paling atra nyaéta dina galur anu kakurangan sinyal JA, karagaman métabolom sareng parobahan spésialisasi anu disababkeun ku herbivora ampir sagemblengna dihapus (Gambar 3C). Sabalikna, persepsi ET anu jempé dina pepelakan sETR1, sanaos pangaruh sakabéhna kana parobahan dina métabolisme herbivora jauh langkung handap tibatan sinyal JA, ngirangan bédana dina indéks Hj sareng δj antara éksitasi OSM sareng OSS1 (Gambar 3D sareng Gambar S5). . Ieu nunjukkeun yén salian ti fungsi inti transduksi sinyal JA, transduksi sinyal ET ogé janten panyesuaian réspon métabolik spésifik spésiés herbivora. Saluyu sareng fungsi panyesuaian ieu, teu aya parobahan dina indukbilitas métabolom sakabéhna dina pepelakan sETR1. Di sisi séjén, dibandingkeun sareng pepelakan sETR1, pepelakan irACO ngainduksi amplitudo sakabéhna anu sami tina parobahan métabolik anu disababkeun ku herbivora, tapi nunjukkeun skor Hj sareng δj anu béda sacara signifikan antara tantangan OSM sareng OSS1 (Gambar S5).
Pikeun ngaidentipikasi metabolit khusus anu gaduh kontribusi penting kana réspon spésifik spésiés herbivora sareng nyaluyukeun produksina ngalangkungan sinyal ET, kami nganggo metode MS/MS struktural anu parantos dikembangkeun sateuacanna. Metode ieu ngandelkeun metode bi-clustering pikeun nyimpulkeun deui kulawarga métabolik tina fragmen MS/MS [produk titik normalisasi (NDP)] sareng skor kamiripan dumasar kana karugian nétral (NL). Set data MS/MS anu diwangun ngalangkungan analisis garis transgenik ET ngahasilkeun 585 MS/MS (file data S1), anu direngsekeun ku cara ngagolongkeun kana tujuh modul MS/MS utama (M) (Gambar 4A). Sababaraha modul ieu padet ku metabolit khusus anu parantos dicirikeun sateuacanna: contona, M1, M2, M3, M4 sareng M7 beunghar ku rupa-rupa turunan fenol (M1), glikosida flavonoid (M2), gula asil (M3 Sareng M4), sareng 17-HGL-DTG (M7). Salian ti éta, informasi spésifik métabolik (indéks Si) tina hiji metabolit dina unggal modul diitung, sareng distribusi Si na tiasa ditingali sacara intuitif. Singkatna, spéktra MS/MS anu nunjukkeun spésifisitas herbivora sareng génotip anu luhur dicirikeun ku nilai Si anu luhur, sareng statistik kurtosis nunjukkeun distribusi bulu dina pojok buntut katuhu. Salah sahiji distribusi koloid ramping sapertos kitu dideteksi dina M1, dimana fenol amida nunjukkeun fraksi Si pangluhurna (Gambar 4B). 17-HGL-DTG anu tiasa diinduksi herbivora anu disebatkeun sateuacanna dina M7 nunjukkeun skor Si sedeng, nunjukkeun tingkat pangaturan diferensial sedeng antara dua jinis OS. Sabalikna, kalolobaan metabolit khusus anu dihasilkeun sacara konstitutif, sapertos rutin, CGA, sareng gula asil, mangrupikeun salah sahiji skor Si panghandapna. Pikeun langkung ngajalajah kompleksitas struktural sareng distribusi Si antara metabolit khusus, jaringan molekuler diwangun pikeun unggal modul (Gambar 4B). Prediksi penting tina téori OD (diringkeskeun dina Gambar 1B) nyaéta yén reorganisasi metabolit khusus saatos herbivora kedah nyababkeun parobahan hiji arah dina metabolit kalayan nilai pertahanan anu luhur, khususna ku cara ningkatkeun spésifisitasna (sabalikna tina distribusi acak) Mode) Métabolit pertahanan anu diprediksi ku téori MT. Kaseueuran turunan fenol anu akumulasi dina M1 sacara fungsional aya hubunganana sareng turunna kinerja serangga (32). Nalika ngabandingkeun nilai Si dina metabolit M1 antara daun anu diinduksi sareng daun konstituén pepelakan kontrol EV dina 24 jam, urang niténan yén spésifisitas métabolik seueur metabolit saatos serangga herbivora gaduh tren ningkat anu signifikan (Gambar 4C). Kanaékan spésifik dina nilai Si ngan ukur dideteksi dina fenolamida pertahanan, tapi teu aya paningkatan dina nilai Si anu dideteksi dina fenol sanés sareng metabolit anu teu dipikanyaho anu aya dina modul ieu. Ieu mangrupikeun modél khusus, anu aya hubunganana sareng téori OD. Prediksi utama parobahan métabolik anu disababkeun ku herbivora konsisten. Pikeun nguji naha spésifisitas spéktrum fenolamida ieu diinduksi ku ET spésifik OS, urang ngaplot indéks metabolit Si sareng nyababkeun nilai éksprési diferensial antara OSM sareng OSS1 dina genotipe EV sareng sETR1 (Gambar 4D). Dina sETR1, bédana anu diinduksi ku fenamida antara OSM sareng OSS1 dikirangan pisan. Métode bi-clustering ogé diterapkeun kana data MS/MS anu dikumpulkeun dina galur anu JA-na teu cekap pikeun nyimpulkeun modul MS/MS utama anu aya hubunganana sareng spésialisasi métabolik anu diatur ku JA (Gambar S6).
(A) Hasil klasterisasi 585 MS/MS dumasar kana fragmen anu dibagi (kamiripan NDP) sareng karugian nétral anu dibagi (kamiripan NL) ngahasilkeun modul (M) anu konsisten sareng kulawarga sanyawa anu dipikanyaho, atanapi ku komposisi Metabolit anu teu dipikanyaho atanapi dimetabolisme kalayan goréng. Gigireun unggal modul, distribusi spésifik metabolit (MS/MS) (Si) dipidangkeun. (B) Jaringan molekular modular: Node ngagambarkeun MS/MS sareng ujung, skor MS/MS NDP (beureum) sareng NL (biru) (cut-off,> 0,6). Indéks spésifisitas metabolit anu dinilai (Si) diwarnaan dumasar kana modul (kénca) sareng dipetakan kana jaringan molekular (katuhu). (C) Modul M1 tina tutuwuhan EV dina kaayaan konstitutif (kontrol) sareng diinduksi (herbivora simulasi) dina 24 jam: diagram jaringan molekular (nilai Si nyaéta ukuran node, fenolamida pertahanan disorot ku warna biru). (D) Diagram jaringan molekuler M1 tina garis spéktrum sETR1 kalayan persepsi EV sareng ET anu kaganggu: sanyawa fenolik anu digambarkeun ku simpul bunderan héjo, sareng bédana anu signifikan (nilai P) antara perlakuan W + OSM sareng W + OSS1 salaku ukuran Simpul. CP, N-caffeoyl-tirosin; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, asam N-ferulic éster-asam urat; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tirosin; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum dina wolfberry Son; Nick. O-AS, gula O-asil.
Kami langkung ngalegaan analisis tina hiji genotip Nepenthes anu dilemahkeun kana populasi alami, dimana parobahan intraspésifik anu kuat dina tingkat JA herbivora sareng tingkat metabolit spésifik parantos dijelaskeun sateuacanna dina populasi alami (26). Anggo set data ieu pikeun nutupan 43 plasma nutfah. Plasma nutfah ieu diwangun ku 123 spésiés pepelakan ti N. pallens. Tutuwuhan ieu dicandak tina siki anu dikumpulkeun di habitat asli anu béda di Utah, Nevada, Arizona, sareng California (Gambar S7), kami ngitung karagaman métabolom (di dieu disebut tingkat populasi) karagaman β) sareng spésialisasi anu disababkeun ku OSM. Saluyu sareng panilitian sateuacana, kami niténan rupa-rupa parobahan métabolik sapanjang sumbu Hj sareng δj, nunjukkeun yén plasma nutfah gaduh béda anu signifikan dina plastisitas réspon métabolikna kana herbivora (Gambar S7). Organisasi ieu ngingetkeun kana observasi sateuacana ngeunaan rentang dinamis parobahan JA anu disababkeun ku herbivora, sareng parantos ngajaga nilai anu luhur pisan dina hiji populasi (26, 36). Ku ngagunakeun JA sareng JA-Ile pikeun nguji korélasi tingkat sakabéhna antara Hj sareng δj, urang mendakan yén aya korélasi positif anu signifikan antara JA sareng indéks karagaman sareng spesialisasi métabolom β (Gambar S7). Ieu nunjukkeun yén hétérogénitas anu diinduksi ku herbivora dina induksi JA anu dideteksi dina tingkat populasi tiasa disababkeun ku polimorfisme métabolik konci anu disababkeun ku seleksi ti herbivora serangga.
Panilitian samemehna nunjukkeun yén jinis bako béda pisan dina jinisna sareng gumantungna relatif kana pertahanan métabolik anu diinduksi sareng konstitutif. Dipercaya yén parobahan dina transduksi sinyal anti-herbivora sareng kamampuan pertahanan ieu diatur ku tekanan populasi serangga, siklus hirup pepelakan, sareng biaya produksi pertahanan dina niche dimana spésiés anu dipasihkeun tumbuh. Kami nalungtik konsistensi remodeling métabolom daun anu diinduksi ku herbivora genep spésiés Nicotiana anu asalna ti Amérika Kalér sareng Amérika Kidul. Spésiés ieu raket patalina sareng Nepenthes Amérika Kalér, nyaéta Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. jukut anu dilemahkeun, Nicotiana tabacum, bako linier, bako (Nicotiana spegazzinii) sareng bako daun bako (Nicotiana obtusifolia) (Gambar 5A) (37). Genep spésiés ieu, kalebet spésiés anu dicirikeun kalayan saé N. mangga, mangrupikeun pepelakan taunan tina clade petunia, sareng obtusifolia N. mangrupikeun pepelakan taunan tina clade sadulur Trigonophyllae (38). Salajengna, induksi W + W, W + OSM sareng W + OSS1 dilaksanakeun dina tujuh spésiés ieu pikeun nalungtik pangaturan ulang métabolik tingkat spésiés tina tuangeun serangga.
(A) Tangkal filogenetik bootstrap dumasar kana kamungkinan maksimum [pikeun sintésis glutamin nuklir (38)] sareng distribusi geografis tujuh spésiés Nicotiana anu raket patalina (warna anu béda) (37). (B) Plot sebaran karagaman khusus pikeun profil métabolik tujuh spésiés Nicotiana (939 MS/MS; file data S1). Dina tingkat spésiés, karagaman métabolom berkorelasi négatif sareng tingkat spésialisasi. Analisis korélasi tingkat spésiés antara karagaman métabolik sareng spésialisasi sareng akumulasi JA dipidangkeun dina Gambar 2. S9. Warna, jinis anu béda; segitiga, W + OSS1; pasagi panjang, W + OSM; (C) Dinamika Nicotiana JA sareng JA-Ile dirangking numutkeun amplitudo éksitasi OS (ANOVA dua arah sareng Tukey HSD pasca-perbandingan sababaraha, * P <0,05, ** P <0,01 sareng * ** Pikeun babandingan W + OS sareng W + W, P <0,001). Plot kotak (D) karagaman sareng (E) spesialisasi unggal spésiés saatos simulasi herbivora sareng metil JA (MeJA). Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan antara W + OS sareng W + W atanapi lanolin ditambah W (Lan + W) atanapi Lan ditambah MeJA (Lan + MeJa) sareng kontrol Lan (analisis varian dua arah, dituturkeun ku perbandingan berganda post hoc HSD Tukey, *P<0,05, **P<0,01 sareng ***P<0,001).
Ngagunakeun metode klaster ganda, urang ngaidentipikasi 9 modul tina 939 MS/MS (file data S1). Komposisi MS/MS anu dikonfigurasi ulang ku perlakuan anu béda-béda béda-béda pisan di antara modul anu béda antara spésiés (Gambar S8). Visualisasi Hj (disebut di dieu salaku γ-diversity tingkat spésiés) sareng δj ngungkabkeun yén spésiés anu béda-béda ngahiji kana kelompok anu béda pisan dina rohangan métabolik, dimana divisi tingkat spésiés biasana langkung nonjol tibatan éksitasi. Iwal N. linear sareng N. obliquus, aranjeunna nunjukkeun rentang dinamis anu lega tina épék induksi (Gambar 5B). Sabalikna, spésiés sapertos N. purpurea sareng N. obtusifolia gaduh réspon métabolik anu kirang atra kana perlakuan, tapi métabolomna langkung beragam. Distribusi spésifik spésiés tina réspon métabolik anu diinduksi nyababkeun korélasi négatif anu signifikan antara spésialisasi sareng diversity gamma (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10-8). Parobahan tingkat JA anu diinduksi ku OS berkorelasi positif sareng spesialisasi métabolom, sareng berkorelasi négatif sareng karagaman gamma métabolik anu dipidangkeun ku unggal spésiés (Gambar 5B sareng Gambar S9). Perlu dicatet yén spésiés anu sacara umum disebut spésiés "réspon sinyal" dina Gambar 5C, sapertos Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, sareng Nepenthes attenuated, nyababkeun tanda-tanda anu signifikan dina 30 menit. Wabah JA sareng JA-Ile spésifik OS anyar, sedengkeun baktéri sanés anu disebut "signal unresponsive", sapertos Nepenthes mills, Nepenthes powdery sareng N. obtusifolia ngan ukur nunjukkeun induksi JA-Ile Edge tanpa spésifisitas OS (Gambar 5C). Dina tingkat métabolik, sapertos anu disebatkeun di luhur, pikeun Nepenthes anu dilemahkeun, zat anu responsif kana sinyal nunjukkeun spésifisitas OS sareng ningkatkeun δj sacara signifikan, bari ngirangan Hj. Éfék priming spésifik OS ieu henteu dideteksi dina spésiés anu diklasifikasikeun salaku spésiés sinyal non-réaktif (Gambar 5, D sareng E). Métabolit spésifik OS langkung sering dibagi antara spésiés anu responsif kana sinyal, sareng gugusan sinyal ieu gugusan sareng spésiés anu réspon sinyalna langkung lemah, sedengkeun spésiés anu réspon sinyalna langkung lemah nunjukkeun saling gumantungna anu langkung sakedik (Gambar S8). Hasil ieu nunjukkeun yén induksi JA spésifik OS sareng konfigurasi ulang spésifik OS tina métabolom hilir digabungkeun dina tingkat spésiés.
Salajengna, urang nganggo pasta lanolin anu ngandung metil JA (MeJA) pikeun ngubaran pepelakan pikeun nalungtik naha modeu gandéngan ieu diwatesan ku kasadiaan JA anu diterapkeun ku JA éksogén, anu bakal aya dina sitoplasma pepelakan. Deesterifikasi gancang nyaéta JA. Urang mendakan tren anu sami tina parobahan laun tina spésiés anu responsif kana sinyal ka spésiés anu henteu responsif kana sinyal anu disababkeun ku suplai JA anu terus-terusan (Gambar 5, D sareng E). Singkatna, perlakuan MeJA sacara kuat ngaprogram ulang métabolom nematoda linier, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, sareng N. mikimotoi, anu ngahasilkeun paningkatan anu signifikan dina δj sareng panurunan dina Hj. N. purpurea ngan ukur nunjukkeun paningkatan dina δj, tapi henteu dina Hj. N. obtusifolia, anu sateuacanna parantos dipidangkeun ngumpulkeun tingkat JA anu handap pisan, ogé ngaréspon goréng kana perlakuan MeJA dina hal konfigurasi ulang métabolom. Hasil ieu nunjukkeun yén produksi JA atanapi transduksi sinyal diwatesan sacara fisiologis dina spésiés anu henteu responsif kana sinyal. Pikeun nguji hipotesis ieu, urang nalungtik opat spésiés (N. pallens, N. mills, N. pink sareng N. microphylla) anu diinduksi ku W + W, W + OSM sareng W + OSS1 Transcriptome (39). Saluyu sareng pola remodeling metabolit, spésiésna dipisahkeun kalayan saé dina rohangan transkriptom, diantarana N. anu dilemahkeun nunjukkeun RDPI anu diinduksi OS pangluhurna, sedengkeun N. gracilis ngagaduhan anu panghandapna (Gambar 6A). Nanging, kapendak yén karagaman transkriptom anu diinduksi ku N. oblonga mangrupikeun anu panghandapna di antara opat spésiés, sabalikna tina karagaman metabonomi pangluhurna N. oblonga anu sateuacanna dipidangkeun dina tujuh spésiés. Panilitian sateuacana parantos nunjukkeun yén sakumpulan gén anu aya hubunganana sareng sinyal pertahanan awal, kalebet sinyal JA, ngajelaskeun spésifisitas réspon pertahanan awal anu diinduksi ku elisitor anu aya hubunganana sareng herbivora dina spésiés Nicotiana (39). Ngabandingkeun jalur sinyal JA antara opat spésiés ieu ngungkabkeun pola anu pikaresepeun (Gambar 6B). Kaseueuran gén dina jalur ieu, sapertos AOC, OPR3, ACX sareng COI1, nunjukkeun tingkat induksi anu kawilang luhur dina opat spésiés ieu. Nanging, gén konci, JAR4, ngarobih JA kana bentuk transkrip akumulasi JA-Ile anu aktip sacara biologis, sareng tingkat transkripsi na handap pisan, khususna dina N. mills, Nepenthes pieris sareng N. microphylla. Salian ti éta, ngan ukur transkrip gén AOS anu sanés anu henteu dideteksi dina N. bifidum. Parobihan dina éksprési gén ieu tiasa janten tanggung jawab kana fenotipe ekstrim anu diinduksi ku produksi JA anu handap dina spésiés anergik sinyal sareng induksi N. gracilis.
(A) Analisis téori informasi ngeunaan pamrograman ulang réspon transkripsi awal tina opat spésiés bako anu raket patalina anu disampel 30 menit saatos induksi herbivora. RDPI diitung ku cara ngabandingkeun daun anu diinduksi ku OS herbivora sareng kontrol tatu. Warna-warna nunjukkeun spésiés anu béda, sareng simbol-simbol nunjukkeun metode perlakuan anu béda. (B) Analisis éksprési gén dina jalur sinyal JA di antara opat spésiés. Jalur JA anu disederhanakeun dipidangkeun di gigireun plot kotak. Warna anu béda nunjukkeun metode pamrosésan anu béda. Asterisk nunjukkeun yén aya béda anu signifikan antara perlakuan W + OS sareng kontrol W + W (pikeun uji-t Student pikeun bédana pasangan, *P<0,05, **P<0,01 sareng ***P<0,001). OPDA, asam 12-oksofitodienoat; OPC-8: asam 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenyl)-siklopentana-1-oktanoat.
Dina bagian pamungkas, urang nalungtik kumaha remodeling spésifik spésiés serangga tina métabolom spésiés tutuwuhan anu béda-béda tiasa tahan ka herbivora. Panalungtikan sateuacanna nekenkeun genus Nicotiana. Résistansi maranéhanana ka Ms sareng larva béda pisan (40). Di dieu, urang nalungtik hubungan antara modél ieu sareng plastisitas métabolikna. Ngagunakeun opat spésiés bako di luhur, sareng nguji korélasi antara karagaman sareng spésialisasi métabolom anu disababkeun ku herbivora sareng résistansi tutuwuhan ka Ms sareng Sl, urang mendakan résistansi, karagaman sareng spésialisasi ka Sl All generalis berkorelasi positif, sedengkeun korélasi antara résistansi ka awéwé ahli sareng spésialisasi lemah, sareng korélasi sareng karagaman henteu signifikan (Gambar S10). Ngeunaan résistansi S1, duanana N. chinensis sareng N. gracilis anu dilemahkeun, anu sateuacanna dipidangkeun nunjukkeun tingkat transduksi sinyal JA sareng plastisitas métabolom, ngagaduhan réspon anu béda pisan kana induksi herbivora, sareng aranjeunna ogé nunjukkeun résistansi anu sami. Jenis kelamin.
Dina genep puluh taun ka pengker, téori pertahanan tutuwuhan parantos nyayogikeun kerangka téoritis, anu dumasar kana para panaliti parantos ngaduga sajumlah ageung évolusi sareng fungsi metabolit khusus tutuwuhan. Kaseueuran téori ieu henteu nuturkeun prosedur normal inferensi anu kuat (41). Éta ngajukeun prediksi konci (3) dina tingkat analisis anu sami. Nalika uji prediksi konci ngamungkinkeun téori khusus dianalisis, ieu bakal ngajantenkeun Widang ieu maju. Didukung, tapi nolak anu sanés (42). Sabalikna, téori énggal ngadamel prediksi dina tingkat analisis anu béda sareng nambihan lapisan pertimbangan deskriptif énggal (42). Nanging, dua téori anu diusulkeun dina tingkat fungsional, MT sareng OD, tiasa dijelaskeun kalayan gampang salaku prediksi penting ngeunaan parobahan métabolik khusus anu disababkeun ku herbivora: Téori OD percaya yén parobahan dina "rohangan" métabolik khusus kacida arahna. Téori MT percaya yén parobahan ieu bakal henteu arah sareng sacara acak ayana dina rohangan métabolik, sareng condong gaduh metabolit nilai pertahanan anu luhur. Pamariksaan sateuacanna ngeunaan prediksi OD sareng MT parantos diuji nganggo sakumpulan sempit sanyawa "pertahanan" a priori. Tés anu museur kana métabolit ieu nyegah kamampuan pikeun nganalisis tingkat sareng lintasan konfigurasi ulang métabolom salami herbivora, sareng henteu ngamungkinkeun uji coba dina kerangka statistik anu konsisten pikeun meryogikeun prediksi konci anu tiasa dianggap sacara gembleng. Ngitung parobahan dina métabolom tutuwuhan. Di dieu, urang nganggo téknologi inovatif dina métabolom dumasar kana MS komputasi sareng ngalaksanakeun analisis MS dekonvolusi dina mata uang umum déskriptor téori inpormasi pikeun nguji bédana antara dua anu diusulkeun dina tingkat métabolom global. Prediksi konci téori ieu. Téori inpormasi parantos diterapkeun dina seueur widang, khususna dina kontéks panalungtikan kaanekaragaman hayati sareng aliran nutrisi (43). Nanging, sakumaha anu urang terang, ieu mangrupikeun aplikasi munggaran anu dianggo pikeun ngajelaskeun rohangan inpormasi métabolik tutuwuhan sareng ngarengsekeun masalah ékologis anu aya hubunganana sareng parobahan métabolik samentawis dina réspon kana isyarat lingkungan. Khususna, kamampuan metode ieu aya dina kamampuanna pikeun ngabandingkeun pola dina sareng antara spésiés tutuwuhan pikeun nalungtik kumaha herbivora parantos mekar ti spésiés anu béda ka pola makroévolusi antar spésiés dina tingkat évolusi anu béda. Métabolisme.
Analisis komponén utama (PCA) ngarobah susunan data multivariat kana rohangan réduksi diménsionalitas supados tren utama data tiasa dijelaskeun, janten biasana dianggo salaku téknik éksplorasi pikeun nganalisis susunan data, sapertos métabolom dekonvolusi. Nanging, réduksi diménsionalitas bakal kaleungitan sabagian tina eusi inpormasi dina susunan data, sareng PCA henteu tiasa nyayogikeun inpormasi kuantitatif ngeunaan ciri anu khusus relevan sareng téori ékologis, sapertos: kumaha herbivora ngonpigurasikeun deui karagaman dina widang khusus (contona, kabeungharan, distribusi) Sareng kaayaanana) metabolit? Métabolit mana anu mangrupikeun prediktor kaayaan anu diinduksi tina herbivora anu dipasihkeun? Tina sudut pandang spésifisitas, karagaman sareng induktibilitas, eusi inpormasi tina profil metabolit spésifik daun diuraikeun, sareng kapendak yén tuang herbivora tiasa ngaktipkeun métabolisme spésifik. Tanpa disangka-sangka, urang niténan yén, sapertos anu dijelaskeun dina indikator téori inpormasi anu dilaksanakeun, kaayaan métabolik anu dihasilkeun gaduh tumpang tindih anu ageung saatos serangan dua herbivora (generalis anu tuang wengi Sl) sareng ahli Solanaceae Ms. Sanaos paripolah sareng konsentrasi tuangna béda sacara signifikan. Inisiator konjugat asam lemak-asam amino (FAC) dina OS (31). Ku ngagunakeun OS herbivora pikeun ngubaran tatu tusukan standar, perlakuan herbivora simulasi ogé nunjukkeun tren anu sami. Prosedur standar ieu pikeun simulasi réspon tutuwuhan kana serangan herbivora ngaleungitkeun faktor pangganggu anu disababkeun ku parobahan dina paripolah tuang herbivora, anu nyababkeun rupa-rupa tingkat karusakan dina waktos anu béda (34). FAC, anu dipikanyaho janten panyabab utama OSM, ngirangan JAS sareng réspon hormon tutuwuhan sanés dina OSS1, sedengkeun OSS1 ngirangan ratusan kali (31). Nanging, OSS1 nyababkeun tingkat akumulasi JA anu sami dibandingkeun sareng OSM. Sateuacanna parantos dipidangkeun yén réspon JA dina Nepenthes anu dilemahkeun sénsitip pisan ka OSM, dimana FAC tiasa ngajaga aktivitasna sanaos diéncérkeun 1:1000 ku cai (44). Ku alatan éta, dibandingkeun sareng OSM, sanaos FAC dina OSS1 rendah pisan, éta cekap pikeun nimbulkeun wabah JA anu cekap. Panilitian samemehna nunjukkeun yén protéin kawas porin (45) sareng oligosakarida (46) tiasa dianggo salaku petunjuk molekuler pikeun micu réspon pertahanan tutuwuhan dina OSS1. Nanging, masih teu jelas naha elisitor ieu dina OSS1 tanggung jawab kana akumulasi JA anu dititénan dina panilitian ayeuna.
Sanaos aya sababaraha panilitian anu ngajelaskeun sidik jari métabolik diferensial anu disababkeun ku aplikasi herbivora anu béda atanapi JA atanapi SA éksogén (asam salisilat) (47), teu aya anu ngaganggu gangguan spésifik spésiés herbivora dina jaringan jukut pepelakan sareng pangaruhna kana inpormasi pribadi anu spésifik. Analisis ieu salajengna mastikeun yén sambungan jaringan hormon internal sareng hormon pepelakan sanés lian ti JA ngabentuk spésifisitas reorganisasi métabolik anu disababkeun ku herbivora. Khususna, kami mendakan yén ET anu disababkeun ku OSM sacara signifikan langkung ageung tibatan anu disababkeun ku OSS1. Modeu ieu konsisten sareng langkung seueur eusi FAC dina OSM, anu mangrupikeun kaayaan anu diperyogikeun sareng cekap pikeun micu ledakan ET (48). Dina kontéks interaksi antara pepelakan sareng herbivora, fungsi sinyal ET dina dinamika métabolit spésifik pepelakan masih sporadis sareng ngan ukur narékahan hiji kelompok sanyawa. Salian ti éta, kalolobaan panilitian parantos nganggo aplikasi éksogén ET atanapi prékursorna atanapi rupa-rupa inhibitor pikeun nalungtik pangaturan ET, diantarana aplikasi kimia éksogén ieu bakal ngahasilkeun seueur efek samping anu henteu spésifik. Numutkeun pangaweruh urang, panilitian ieu mangrupikeun pamariksaan sistematis skala ageung anu munggaran ngeunaan peran ET dina panggunaan ET pikeun ngahasilkeun sareng ningali pepelakan transgenik anu kaganggu pikeun koordinasi dinamika métabolom pepelakan. Induksi ET spésifik herbivora pamustunganana tiasa ngamodulasi réspon métabolom. Anu paling penting nyaéta manipulasi transgenik tina biosintésis ET (ACO) sareng gén persépsi (ETR1) anu ngungkabkeun akumulasi fenolamida de novo spésifik herbivora. Sateuacanna parantos dipidangkeun yén ET tiasa ngaropea akumulasi nikotin anu diinduksi JA ku cara ngatur putrescine N-methyltransferase (49). Nanging, tina sudut pandang mékanis, teu jelas kumaha ET ngaropea induksi fenamida. Salian ti fungsi transduksi sinyal ET, fluks métabolik ogé tiasa dialihkeun ka S-adenosil-1-metionin pikeun ngatur investasi dina poliaminofenol amida. S-adenosil-1-metionin nyaéta ET sareng perantara umum tina jalur biosintésis poliamina. Mékanisme kumaha sinyal ET ngatur tingkat fenolamida peryogi panilitian salajengna.
Lila pisan, kusabab seueurna metabolit khusus anu strukturna teu dipikanyaho, perhatian anu kuat kana kategori métabolik khusus teu tiasa sacara ketat meunteun parobahan temporal tina karagaman métabolik saatos interaksi biologis. Ayeuna, dumasar kana analisis téori informasi, hasil utama akuisisi spéktrum MS/MS dumasar kana metabolit anu teu bias nyaéta herbivora anu ngahakan atanapi simulasi herbivora terus ngirangan karagaman métabolik sakabéhna tina métabolom daun bari ningkatkeun tingkat spésialisasina. Kanaékan spésifisitas métabolom samentawis ieu anu disababkeun ku herbivora aya hubunganana sareng paningkatan sinergis dina spésifisitas transkriptom. Fitur anu paling nyumbang kana spésialisasi métabolom anu langkung ageung ieu (anu gaduh nilai Si anu langkung luhur) nyaéta métabolit khusus kalayan fungsi herbivora anu dicirikeun sateuacanna. Modél ieu saluyu sareng prediksi téori OD, tapi prediksi MT anu aya hubunganana sareng kaacakan program ulang métabolom henteu konsisten. Nanging, data ieu ogé saluyu sareng prediksi modél campuran (MT pangsaéna; Gambar 1B), sabab métabolit anu teu dicirikeun sanés kalayan fungsi pertahanan anu teu dipikanyaho masih tiasa nuturkeun distribusi Si acak.
Pola anu penting anu salajengna ditangkep ku ieu panalungtikan nyaéta ti tingkat mikro-évolusi (populasi pepelakan tunggal sareng bako) dugi ka skala évolusi anu langkung ageung (spésiés bako anu raket patalina), tingkat organisasi évolusi anu béda-béda aya dina "pertahanan anu pangsaéna". Aya béda anu signifikan dina kamampuan herbivora. Moore et al. (20) sareng Kessler sareng Kalske (1) sacara mandiri ngusulkeun pikeun ngarobih tilu tingkat fungsional kaanekaragaman hayati anu mimitina dibédakeun ku Whittaker (50) kana parobahan temporal konstitutif sareng diinduksi tina kaanekaragaman kimia; panulis ieu henteu ngaringkeskeun Prosedur pikeun pangumpulan data métabolom skala ageung ogé henteu ngajelaskeun kumaha ngitung kaanekaragaman métabolik tina data ieu. Dina panilitian ieu, panyesuaian minor kana klasifikasi fungsional Whittaker bakal mertimbangkeun kaanekaragaman α-métabolik salaku kaanekaragaman spéktra MS / MS dina pepelakan anu dipasihkeun, sareng kaanekaragaman β-métabolik salaku métabolisme intraspésifik dasar tina sakelompok populasi Spasi, sareng kaanekaragaman γ-métabolik bakal janten perpanjangan tina analisis spésiés anu sami.
Sinyal JA penting pisan pikeun rupa-rupa réspon métabolik herbivora. Nanging, kurangna uji kuantitatif anu ketat ngeunaan kontribusi pangaturan intraspésifik biosintésis JA kana karagaman métabolom, sareng naha sinyal JA mangrupikeun situs umum pikeun diversifikasi métabolom anu diinduksi setrés dina skala makroévolusi anu langkung luhur masih hésé dititénan. Kami niténan yén sipat herbivora Nepenthes herbivora ngainduksi spésialisasi métabolom sareng variasi spésialisasi métabolom dina populasi spésiés Nicotiana sareng di antara spésiés Nicotiana anu raket patalina sacara sistematis berkorelasi positif sareng sinyal JA. Salaku tambahan, nalika sinyal JA kaganggu, spésifisitas métabolik anu diinduksi ku hiji génotip herbivora bakal dibatalkeun (Gambar 3, C sareng E). Kusabab parobahan spéktrum métabolik tina populasi Nepenthes anu dilemahkeun sacara alami biasana kuantitatif, parobahan dina karagaman β métabolik sareng spésifisitas dina analisis ieu tiasa disababkeun ku éksitasi anu kuat tina kategori sanyawa anu beunghar métabolit. Kelas sanyawa ieu ngadominasi sabagian tina profil métabolom sareng ngarah kana korélasi positif sareng sinyal JA.
Kusabab mékanisme biokimia spésiés bako anu raket patalina sareng éta béda pisan, metabolitna diidentipikasi sacara khusus dina aspék kualitatif, janten langkung analitis. Pamrosésan téori informasi ngeunaan profil métabolik anu direkam ngungkabkeun yén induksi herbivora ngagedekeun trade-off antara karagaman gamma métabolik sareng spésialisasi. Sinyal JA maénkeun peran sentral dina trade-off ieu. Kanaékan spésialisasi métabolom saluyu sareng prediksi OD utama sareng berkorelasi positif sareng sinyal JA, sedengkeun sinyal JA berkorelasi négatif sareng karagaman gamma métabolik. Modél ieu nunjukkeun yén kapasitas OD pepelakan utamina ditangtukeun ku plastisitas JA, naha dina skala mikroévolusi atanapi dina skala évolusionér anu langkung ageung. Ékspérimén aplikasi JA éksogén anu ngurilingan cacad biosintésis JA salajengna ngungkabkeun yén spésiés bako anu raket patalina tiasa dibédakeun kana spésiés anu responsif sinyal sareng henteu responsif sinyal, sapertos mode JA sareng plastisitas métabolom anu diinduksi ku herbivora. Spésiés anu henteu responsif sinyal henteu tiasa ngaréspon kusabab henteu mampuh ngahasilkeun JA éndogén sareng ku kituna tunduk kana watesan fisiologis. Ieu tiasa disababkeun ku mutasi dina sababaraha gén konci dina jalur sinyal JA (AOS sareng JAR4 dina N. crescens). Hasil ieu nyorot yén pola makroévolusi antarspésiés ieu tiasa utamina didorong ku parobahan dina persépsi sareng résponsif hormon internal.
Salian ti interaksi antara tutuwuhan sareng herbivora, éksplorasi karagaman métabolik aya hubunganana sareng sadaya kamajuan téoritis anu penting dina panalungtikan adaptasi biologis kana lingkungan sareng évolusi sipat fenotipik anu rumit. Kalayan ningkatna jumlah data anu diala ku instrumen MS modéren, uji hipotesis ngeunaan karagaman métabolik ayeuna tiasa ngaleuwihan bédana métabolit individu/kategori sareng ngalaksanakeun analisis global pikeun ngungkabkeun pola anu teu kaduga. Dina prosés analisis skala ageung, métafora anu penting nyaéta ide pikeun nyusun peta anu bermakna anu tiasa dianggo pikeun ngajalajah data. Ku alatan éta, hasil anu penting tina kombinasi ayeuna tina métabolom MS/MS anu teu bias sareng téori inpormasi nyaéta nyayogikeun métrik saderhana anu tiasa dianggo pikeun ngawangun peta pikeun ngotéktak karagaman métabolik dina skala taksonomi anu béda. Éta mangrupikeun sarat dasar tina metode ieu. Ulikan ngeunaan évolusi mikro/makro sareng ékologi komunitas.
Dina tingkat makro-évolusi, inti tina téori koévolusi tutuwuhan-serangga Ehrlich sareng Raven (51) nyaéta pikeun ngaduga yén variasi karagaman métabolik antarspésiés mangrupikeun panyabab diversifikasi garis keturunan tutuwuhan. Nanging, dina lima puluh taun saprak dipedalkeunana karya mani ieu, hipotesis ieu jarang diuji (52). Ieu utamina kusabab karakteristik filogenetik tina karakteristik métabolik anu sami dina garis keturunan tutuwuhan jarak jauh. Kalangkaan ieu tiasa dianggo pikeun ngajangkarkeun metode analisis target. Alur kerja MS/MS ayeuna anu diolah ku téori inpormasi ngitung kamiripan struktural MS/MS tina metabolit anu teu dipikanyaho (tanpa pilihan metabolit sateuacanna) sareng ngarobih MS/MS ieu kana sakumpulan MS/MS, ku kituna dina métabolisme profésional Modél makro-évolusi ieu dibandingkeun dina skala klasifikasi. Indikator statistik saderhana. Prosésna sami sareng analisis filogenetik, anu tiasa nganggo panyelarasan runtuyan pikeun ngitung laju diversifikasi atanapi évolusi karakter tanpa prediksi sateuacanna.
Dina tingkat biokimia, hipotesis panyaringan Firn sareng Jones (53) nunjukkeun yén karagaman métabolik dijaga dina tingkat anu béda pikeun nyayogikeun bahan baku pikeun ngalaksanakeun kagiatan biologis metabolit anu sateuacanna teu aya hubunganana atanapi anu diganti. Métode téori informasi nyayogikeun kerangka dimana transisi évolusionér spésifik metabolit ieu anu lumangsung nalika spésialisasi metabolit tiasa diukur salaku bagian tina prosés panyaringan évolusionér anu diusulkeun: adaptasi aktif sacara biologis tina spésifisitas rendah ka spésifisitas tinggi Métabolit anu dihambat tina lingkungan anu dipasihkeun.
Sacara umum, dina mangsa mimiti biologi molekuler, téori pertahanan tutuwuhan anu penting dimekarkeun, sareng métode anu didorong ku hipotesis deduktif sacara lega dianggap hiji-hijina cara pikeun kamajuan ilmiah. Ieu seuseueurna kusabab watesan téknis dina ngukur sakabéh métabolom. Sanaos métode anu didorong ku hipotesis hususna kapaké dina milih mékanisme kausal anu sanés, kamampuanana pikeun ningkatkeun pamahaman urang ngeunaan jaringan biokimia langkung terbatas tibatan métode komputasi anu ayeuna sayogi dina élmu intensif data kontemporer. Ku alatan éta, téori anu teu tiasa diprediksi jauh saluareun ruang lingkup data anu sayogi, janten rumus hipotétis/siklus tés kamajuan dina widang panalungtikan teu tiasa dihapuskeun (4). Kami ngaramalkeun yén alur kerja komputasi métabolomika anu diwanohkeun di dieu tiasa ngahudangkeun deui minat kana masalah anyar (kumaha) sareng ahir (naha) ngeunaan karagaman métabolik, sareng nyumbang kana jaman anyar élmu data anu dipandu sacara téoritis. Jaman éta nalungtik deui téori-téori penting anu ngainspirasi generasi sateuacana.
Pakan herbivora langsung dilaksanakeun ku cara ngangkat larva instar kadua atanapi larva Sl dina hiji daun pepelakan kantong semar warna pucet tina hiji pepelakan mawar anu mekar, kalayan 10 ulangan pepelakan per pepelakan. Larva serangga dijepit ku klem, sareng jaringan daun sésana dikumpulkeun 24 sareng 72 jam saatos inféksi sareng dibekukeun gancang, teras metabolitna diekstrak.
Simulasikeun perlakuan herbivora ku cara anu sinkron pisan. Métodena nyaéta nganggo roda pola lawon pikeun nusuk tilu jajar cucuk dina unggal sisi iga tengah tilu daun pepelakan anu geus mekar pinuh salami tahap kamekaran karangan lawon, teras langsung nerapkeun 1:5 Ms anu diéncérkeun. Atawa nganggo ramo anu nganggo sarung tangan pikeun nyelapkeun S1 OS kana tatu tusukan. Panén sareng olah daun sapertos anu dijelaskeun di luhur. Anggo metode anu dijelaskeun sateuacanna pikeun ngekstrak metabolit primér sareng hormon pepelakan (54).
Pikeun aplikasi JA éksogén, tilu daun gagang daun tina unggal genep pepelakan kembangan mawar tina unggal spésiés dirawat ku 20μl pasta lanolin anu ngandung 150μg MeJA (Lan + MeJA), sareng 20μl lanolin ditambah perawatan tatu (Lan + W), atanapi nganggo 20μl lanolin murni salaku kontrol. Daunna dipanén 72 jam saatos perawatan, dibekukeun dina nitrogén cair, sareng disimpen dina suhu -80°C dugi ka dianggo.
Opat galur transgenik JA sareng ET, nyaéta irAOC (36), irCOI1 (55), irACO sareng sETR1 (48), parantos diidentifikasi dina grup panilitian kami. irAOC nunjukkeun panurunan anu kuat dina tingkat JA sareng JA-Ile, sedengkeun irCOI1 henteu sénsitip kana JA. Dibandingkeun sareng EV, akumulasi JA-Ile ningkat. Sarua kitu, irACO bakal ngirangan produksi ET, sareng dibandingkeun sareng EV, sETR1, anu henteu sénsitip kana ET, bakal ningkatkeun produksi ET.
Spektrometer laser fotoakustik (sensor ET real-time Sensor Sense ETD-300) dianggo pikeun ngalakukeun pangukuran ET sacara non-invasif. Langsung saatos perlakuan, satengah daun dipotong teras dipindahkeun kana botol kaca 4 ml anu disegel, sareng rohangan luhur diidinan ngumpul dina 5 jam. Salila pangukuran, unggal botol dibilas ku aliran 2 liter/jam hawa murni salami 8 menit, anu sateuacanna parantos dialirkeun kana katalis anu disayogikeun ku Sensor Sense pikeun miceun CO2 sareng cai.
Data microarray mimitina dipedalkeun dina (35) sareng disimpen dina National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (nomer aksési GSE30287). Data anu pakait sareng daun anu disababkeun ku perlakuan W + OSM sareng kontrol anu teu ruksak diekstrak pikeun panilitian ieu. Inténsitas atahna nyaéta log2. Sateuacan analisis statistik, garis dasar dirobih sareng dinormalisasi kana persentil ka-75 na nganggo pakét parangkat lunak R.
Data sekuensing RNA (RNA-seq) asli spésiés Nicotiana dicandak tina Arsip Bacaan Singkat NCBI (SRA), nomer proyékna nyaéta PRJNA301787, anu dilaporkeun ku Zhou et al. (39) sareng lumangsung sapertos anu dijelaskeun dina (56). Data atah anu diolah ku W + W, W + OSM sareng W + OSS1 anu pakait sareng spésiés Nicotiana dipilih pikeun dianalisis dina panilitian ieu, sareng diolah ku cara ieu: Mimiti, bacaan RNA-seq atah dirobih kana format FASTQ. HISAT2 ngarobih FASTQ ka SAM, sareng SAMtools ngarobih file SAM kana file BAM anu diurutkeun. StringTie dianggo pikeun ngitung éksprési gén, sareng metode éksprési na nyaéta aya fragmen per sarébu fragmen dasar per juta fragmen transkripsi anu diurutkeun.
Kolom kromatografi Acclaim (150 mm x 2,1 mm; ukuran partikel 2,2μm) anu dianggo dina analisis sareng kolom pelindung 4 mm x 4 mm diwangun ku bahan anu sami. Gradien binér ieu dianggo dina sistem Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC): 0 dugi ka 0,5 menit, isokratik 90% A [cai deionisasi, 0,1% (v/v) asetonitril sareng 0,05% asam format], 10% B (Asetonitril sareng 0,05% asam format); 0,5 dugi ka 23,5 menit, fase gradien nyaéta 10% A sareng 90% B, masing-masing; 23,5 dugi ka 25 menit, isokratik 10% A sareng 90% B. Laju aliran nyaéta 400μl/mnt. Pikeun sadaya analisis MS, suntikkeun eluen kolom kana penganalisis quadrupole sareng time-of-flight (qTOF) anu dilengkepan sumber éléktrospray anu beroperasi dina mode ionisasi positif (tegangan kapiler, 4500 V; outlet kapiler 130 V; Suhu pangeringan 200°C; aliran hawa pangeringan 10 liter/mnt).
Laksanakeun analisis fragmen MS / MS (salajengna disebut MS / MS) anu teu relevan atanapi teu tiasa dibédakeun tina data pikeun kéngingkeun inpormasi struktural ngeunaan profil métabolik anu tiasa dideteksi sacara umum. Konsép metode MS / MS anu teu jelas ngandelkeun kanyataan yén quadrupole gaduh jandela isolasi massa anu ageung pisan [ku kituna, anggap sadaya sinyal rasio massa-ka-muatan (m / z) salaku fragmen]. Kusabab kitu, kusabab instrumen Impact II henteu tiasa nyiptakeun kemiringan CE, sababaraha analisis mandiri dilakukeun nganggo nilai énergi tabrakan disosiasi (CE) anu diinduksi tabrakan. Singkatna, mimitina analisa sampel ku ionisasi UHPLC-electrospray / qTOF-MS nganggo mode spéktrométri massa tunggal (kaayaan fragmentasi rendah anu dihasilkeun ku fragmentasi dina sumber), scan ti m / z 50 dugi ka 1500 dina frékuénsi pangulangan 5 Hz. Anggo nitrogén salaku gas tabrakan pikeun analisis MS / MS, sareng laksanakeun pangukuran mandiri dina opat tegangan disosiasi anu diinduksi tabrakan anu béda ieu: 20, 30, 40, sareng 50 eV. Sapanjang prosés pangukuran, quadrupole ngagaduhan jandela isolasi massa panggedéna, ti m/z 50 dugi ka 1500. Nalika awak hareup m/z sareng percobaan lébar isolasi disetel ka 200, rentang massa sacara otomatis diaktipkeun ku parangkat lunak operasi instrumen sareng 0 Da. Pindai fragmen massa sapertos dina modeu massa tunggal. Anggo natrium format (50 ml isopropanol, 200 μl asam format sareng 1 ml larutan cai NaOH 1M) pikeun kalibrasi massa. Nganggo algoritma kalibrasi presisi tinggi Bruker, file data dikalibrasi saatos ngajalankeun spéktrum rata-rata dina jangka waktu anu ditangtukeun. Anggo fungsi ékspor parangkat lunak Analisis Data v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Jerman) pikeun ngarobih file data atah kana format NetCDF. Set data MS/MS parantos disimpen dina database metabolomik kabuka MetaboLights (www.ebi.ac.uk) kalayan nomer aksési. MTBLS1471.
Perakitan MS/MS tiasa diwujudkeun ngalangkungan analisis korélasi antara sinyal kualitas MS1 sareng MS/MS pikeun énergi tabrakan anu handap sareng luhur sareng aturan anu nembé diimplementasikeun. Skrip R dianggo pikeun ngawujudkeun analisis korélasi distribusi prékursor kana produk, sareng skrip C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) dianggo pikeun ngalaksanakeun aturan.
Pikeun ngirangan kasalahan positif palsu anu disababkeun ku gangguan latar sareng korélasi palsu anu disababkeun ku ngadeteksi fitur m/z anu tangtu ngan ukur dina sababaraha sampel, urang nganggo fungsi "puncak anu dieusi" tina pakét R XCMS (pikeun koréksi gangguan latar). Kedah dianggo pikeun ngagentos inténsitas "NA" (puncak anu teu kadeteksi). Nalika fungsi puncak eusian dianggo, masih seueur nilai inténsitas "0" dina set data anu bakal mangaruhan itungan korélasi. Teras, urang ngabandingkeun hasil pamrosésan data anu diala nalika fungsi puncak anu dieusi dianggo sareng nalika fungsi puncak anu dieusi henteu dianggo, sareng ngitung nilai gangguan latar dumasar kana nilai perkiraan rata-rata anu dikoreksi, teras ngagentos nilai inténsitas 0 ieu ku nilai latar anu diitung. Kami ogé ngan ukur mertimbangkeun fitur anu inténsitasna ngaleuwihan tilu kali nilai latar sareng nganggap éta salaku "puncak anu leres." Pikeun itungan PCC, ngan ukur sinyal m/z tina prékursor sampel (MS1) sareng set data fragmen kalayan sahenteuna dalapan puncak anu leres anu dipertimbangkeun.
Upami inténsitas fitur kualitas prékursor dina sakumna sampel aya hubunganana sacara signifikan sareng inténsitas anu dikirangan tina fitur kualitas anu sami anu kakeunaan énergi tabrakan anu handap atanapi luhur, sareng fitur éta henteu dilabélan salaku puncak isotop ku CAMERA, éta tiasa didefinisikeun langkung lanjut. Teras, ku cara ngitung sadaya pasangan prékursor-produk anu mungkin dina 3 detik (perkiraan jandela waktos ingetan pikeun ingetan puncak), analisis korélasi dilaksanakeun. Ngan nalika nilai m/z langkung handap tibatan nilai prékursor sareng fragmentasi MS/MS lumangsung di lokasi sampel anu sami dina set data sapertos prékursor ti mana éta diturunkeun, éta dianggap fragmen.
Dumasar kana dua aturan basajan ieu, urang ngaluarkeun fragmen anu ditangtukeun kalayan nilai m/z anu langkung ageung tibatan m/z tina prékursor anu diidentipikasi, sareng dumasar kana posisi sampel dimana prékursor némbongan sareng fragmen anu ditangtukeun. Éta ogé mungkin pikeun milih fitur kualitas anu dihasilkeun ku seueur fragmen sumber anu dihasilkeun dina modeu MS1 salaku prékursor calon, sahingga ngahasilkeun sanyawa MS/MS anu kaleuleuwihi. Pikeun ngirangan redundansi data ieu, upami kamiripan NDP tina spéktra ngaleuwihan 0,6, sareng aranjeunna kagolong kana kromatogram "pcgroup" anu dianotasi ku CAMERA, urang bakal ngahijikeunana. Pamungkas, urang ngahijikeun sadaya opat hasil CE anu aya hubunganana sareng prékursor sareng fragmen kana spéktrum komposit anu didekonvolusi akhir ku milih puncak inténsitas pangluhurna di antara sadaya puncak calon kalayan nilai m/z anu sami dina énergi tabrakan anu béda. Léngkah-léngkah pamrosésan salajengna dumasar kana konsép spéktrum komposit sareng merhatikeun kaayaan CE anu béda anu diperyogikeun pikeun maksimalkeun kamungkinan fragmentasi, sabab sababaraha fragmen ngan ukur tiasa dideteksi dina énergi tabrakan anu khusus.
RDPI (30) dianggo pikeun ngitung induktibilitas profil métabolik. Karagaman spéktrum métabolik (indéks Hj) diturunkeun tina lobana prékursor MS/MS ngagunakeun éntropi Shannon tina distribusi frékuénsi MS/MS ngagunakeun persamaan ieu anu dijelaskeun ku Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) dimana Pij pakait sareng frékuénsi relatif MS/MS ka-i dina sampel ka-j (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m) t).
Spésifisitas métabolik (indéks Si) dihartikeun salaku idéntitas éksprési MS/MS anu dipasihkeun dina hubunganana sareng frékuénsi antara sampel anu dipertimbangkeun. Spésifisitas MS/MS diitung salaku Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Anggo rumus ieu pikeun ngukur indéks δj spésifik métabolom tina unggal sampel j, sareng rata-rata spésifisitas MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Spéktra MS/MS disusun sacara berpasangan, sareng kamiripan diitung dumasar kana dua skor. Mimitina, nganggo NDP standar (ogé katelah metode korélasi kosinus), anggo persamaan ieu pikeun ngarékam kamiripan segmen antara spéktra NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 dimana S1 sareng S2 Saluyu sareng éta, pikeun spéktrum 1 sareng spéktrum 2, ogé WS1, i sareng WS2, i ngagambarkeun beurat dumasar kana inténsitas puncak yén bédana puncak umum ka-i antara dua spéktra kirang ti 0,01 Da. Beuratna diitung sapertos kieu: W = [inténsitas puncak] m [kualitas] n, m = 0,5, n = 2, sakumaha anu disarankeun ku MassBank.
Métode penilaian kadua dilaksanakeun, anu ngalibatkeun nganalisis NL anu dibagi antara MS/MS. Pikeun tujuan ieu, urang nganggo 52 daptar NL anu sering kapanggih nalika prosés fragmentasi MS sacara babarengan, sareng NL anu langkung spésifik (file data S1) anu sateuacanna parantos dianotasi pikeun spéktrum MS/MS tina metabolit sekundér spésiés Nepenthes anu dilemahkeun (9, 26). Jieun véktor binér 1 sareng 0 pikeun unggal MS/MS, anu saluyu sareng ayeuna sareng anu teu aya tina sababaraha NL masing-masing. Dumasar kana kamiripan jarak Euclidean, skor kamiripan NL diitung pikeun unggal pasangan véktor NL binér.
Pikeun ngalaksanakeun klaster ganda, urang nganggo pakét R DiffCoEx, anu dumasar kana perluasan Analisis Ko-Éksprési Gén Weighted (WGCNA). Ngagunakeun matriks skor NDP sareng NL tina spéktra MS/MS, urang nganggo DiffCoEx pikeun ngitung matriks korélasi komparatif. Klaster binér dilakukeun ku cara nyetel parameter "cutreeDynamic" ka metode = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, sareng minClusterSize = 10. Kode sumber R tina DiffCoEx diunduh tina file tambahan 1 ku Tesson et al. (57); Pakét parangkat lunak R WGCNA anu diperyogikeun tiasa dipendakan di https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Pikeun ngalaksanakeun analisis jaringan molekuler MS/MS, urang ngitung konéktivitas spéktral anu dipasangkan dumasar kana tipe kamiripan NDP sareng NL, sareng nganggo parangkat lunak Cytoscape pikeun ngavisualisasikeun topologi jaringan nganggo tata letak organik dina aplikasi éksténsi algoritma tata letak yFiles CyFilescape.
Anggo R vérsi 3.0.1 pikeun ngalaksanakeun analisis statistik kana data. Signifikansi statistik dipeunteun nganggo analisis varian dua arah (ANOVA), dituturkeun ku uji post-hoc bédana anu signifikan sacara jujur ​​​​Tukey (HSD). Pikeun nganalisis bédana antara perlakuan herbivora sareng kontrol, distribusi dua sisi tina dua kelompok sampel kalayan varian anu sami dianalisis nganggo uji t Student.
Kanggo bahan tambahan pikeun tulisan ieu, mangga tingali http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ieu mangrupikeun artikel aksés kabuka anu disebarkeun dina istilah Lisénsi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, anu ngamungkinkeun panggunaan, distribusi sareng réproduksi dina média naon waé, salami panggunaan akhir sanés pikeun kauntungan komérsial sareng premisna nyaéta karya aslina leres. Rujukan.
Catetan: Kami ngan ukur nyuhunkeun anjeun pikeun masihan alamat email anjeun supados jalmi anu anjeun rekomendasikeun ka halaman éta terang yén anjeun hoyong aranjeunna ningali email éta sareng éta sanés spam. Kami moal ngarékam alamat email naon waé.
Patarosan ieu dianggo pikeun nguji naha anjeun pangunjung sareng nyegah kiriman spam otomatis.
Téori informasi nyadiakeun mata uang universal pikeun babandingan métabolom husus sareng prediksi téori pertahanan tés.
Téori informasi nyadiakeun mata uang universal pikeun babandingan métabolom husus sareng prediksi téori pertahanan tés.
© 2021 Asosiasi Amérika pikeun Kamajuan Élmu. sadaya hak disimpen. AAAS mangrupikeun mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef sareng COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.