Artikel ieu mangrupikeun bagian tina topik panalungtikan "Ningkatkeun résistansi legum kana patogén sareng hama", tingali sadaya 5 artikel
Agen panyabab nekrosis panyakit tutuwuhan jamur Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ngagunakeun strategi multi-tingkat pikeun ngainféksi pepelakan inang anu béda. Panilitian ieu ngajukeun panggunaan diamine L-ornitin, asam amino non-protéin anu ngarangsang sintésis asam amino ésénsial sanésna, salaku strategi manajemen alternatif pikeun ningkatkeun réspon molekuler, fisiologis sareng biokimia Phaseolus vulgaris L. kana kapang bodas anu disababkeun ku Pseudomonas sclerotiorum. Ékspérimén in vitro nunjukkeun yén L-ornitin sacara signifikan ngahambat kamekaran miselium S. pyrenoidosa ku cara anu gumantung kana dosis. Leuwih ti éta, éta tiasa sacara signifikan ngirangan parahna kapang bodas dina kaayaan rumah kaca. Salajengna, L-ornitin ngarangsang kamekaran pepelakan anu dirawat, nunjukkeun yén konsentrasi L-ornitin anu diuji henteu fitotoksik pikeun pepelakan anu dirawat. Salian ti éta, L-ornitin ningkatkeun éksprési antioksidan non-énzimatik (total fenolik sareng flavonoid anu leyur) sareng antioksidan énzimatik (katalase (CAT), peroksidase (POX), sareng polifenol oksidase (PPO)), sareng ningkatkeun éksprési tilu gén anu aya hubunganana sareng antioksidan (PvCAT1, PvSOD, sareng PvGR). Salajengna, analisis in silico ngungkabkeun ayana protéin oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) putatif dina génom S. sclerotiorum, anu ampir sami sareng protéin oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) tina Aspergillus fijiensis (AfOAH) sareng Penicillium sp. (PlOAH) dina hal analisis fungsional, domain anu dilestarikan, sareng topologi. Anu pikaresepeun, panambahan L-ornitin kana média kaldu dekstrosa kentang (PDB) sacara signifikan ngirangan éksprési gén SsOAH dina miselia S. sclerotiorum. Sarua kitu, aplikasi éksogén L-ornitin sacara signifikan ngirangan éksprési gén SsOAH dina miselium jamur anu dikumpulkeun tina pepelakan anu dirawat. Pamungkas, aplikasi L-ornitin sacara signifikan ngirangan sékrési asam oksalat dina média PDB sareng daun anu kainféksi. Kasimpulanana, L-ornitin maénkeun peran konci dina ngajaga status rédoks ogé ningkatkeun réspon pertahanan pepelakan anu kainféksi. Hasil panilitian ieu tiasa ngabantosan dina ngembangkeun metode anu inovatif sareng ramah lingkungan pikeun ngontrol kapang bodas sareng ngirangan dampakna kana produksi kacang sareng pepelakan sanésna.
Kapang bodas, anu disababkeun ku jamur nekrotropik Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, nyaéta panyakit anu ngancurkeun sareng ngirangan hasil panén anu janten ancaman serius pikeun produksi kacang buncis global (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum mangrupikeun salah sahiji patogén pepelakan jamur anu ditularkan ku taneuh anu paling hésé dikontrol, kalayan rentang inang anu lega langkung ti 600 spésiés pepelakan sareng kamampuan pikeun gancang ngamaserasi jaringan inang ku cara anu henteu spésifik (Liang sareng Rollins, 2018). Dina kaayaan anu teu nguntungkeun, éta ngalaman fase kritis tina siklus hirupna, tetep dorman salami waktos anu lami salaku struktur hideung, teuas, sapertos siki anu disebut 'sclerotia' dina taneuh atanapi salaku pertumbuhan bodas, mengembang dina miselium atanapi empulur batang pepelakan anu kainféksi (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum sanggup ngabentuk sclerotia, anu ngamungkinkeun éta salamet di kebon anu kainféksi salami waktos anu lami sareng tetep aya salami panyakit (Schwartz et al., 2005). Sclerotia beunghar ku nutrisi, tiasa tetep aya dina taneuh salami waktos anu lami, sareng janten inokulum utama pikeun inféksi salajengna (Schwartz et al., 2005). Dina kaayaan anu nguntungkeun, sclerotia berkecambah sareng ngahasilkeun spora anu aya di udara anu tiasa ngainféksi sadaya bagian pepelakan di luhur taneuh, kalebet tapi henteu diwatesan ku kembang, batang, atanapi polong (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum ngagunakeun strategi multi-tingkat pikeun ngainféksi pepelakan inangna, anu ngalibatkeun runtuyan kajadian anu terkoordinasi ti mimiti pengecambahan sklerotial dugi ka kamekaran gejala. Mimitina, S. sclerotiorum ngahasilkeun spora anu ngagantung (disebut askospora) tina struktur sapertos supa anu disebut apothecia, anu janten hawa sareng berkembang janten sklerotia anu henteu motil dina sésa-sésa pepelakan anu kainféksi (Bolton et al., 2006). Jamur teras ngaluarkeun asam oksalat, faktor virulénsi, pikeun ngontrol pH témbok sél pepelakan, ngamajukeun degradasi énzimatik sareng invasi jaringan (Hegedus sareng Rimmer, 2005), sareng nyegah ledakan oksidatif pepelakan inang. Prosés pengasaman ieu ngaleuleuskeun témbok sél pepelakan, nyayogikeun lingkungan anu nguntungkeun pikeun operasi normal sareng efisien tina énzim anu ngarusak témbok sél jamur (CWDE), anu ngamungkinkeun patogén pikeun ngungkulan panghalang fisik sareng nembus jaringan inang (Marciano et al., 1983). Sakali ditembus, S. sclerotiorum ngaluarkeun sababaraha CWDE, sapertos poligalakturonase sareng selulase, anu ngagampangkeun panyebaranana dina jaringan anu kainféksi sareng nyababkeun nekrosis jaringan. Kamajuan lési sareng tikar hifa nyababkeun gejala karakteristik kapang bodas (Hegedus sareng Rimmer, 2005). Samentawis éta, pepelakan inang mikawanoh pola molekuler anu aya hubunganana sareng patogén (PAMP) ngalangkungan reséptor pangakuan pola (PRR), anu micu sarangkaian kajadian sinyal anu pamustunganana ngaktipkeun réspon pertahanan.
Sanaos parantos puluhan taun usaha pangendalian panyakit, kakurangan plasma nutfah tahan anu nyukupan tetep aya dina kacang buncis, sapertos dina pepelakan komérsial sanésna, kusabab résistansi, survival, sareng adaptasi patogén. Ku kituna, manajemen panyakit nangtang pisan sareng meryogikeun strategi anu terpadu sareng multifaset anu kalebet kombinasi prakték budaya, kontrol biologis, sareng fungisida kimiawi (O'Sullivan et al., 2021). Pangendalian kimiawi kapang bodas mangrupikeun anu paling efektif sabab fungisida, nalika diterapkeun kalayan leres sareng dina waktos anu pas, tiasa sacara efektif ngontrol panyebaran panyakit, ngirangan parahna inféksi, sareng ngaminimalkeun karugian hasil. Nanging, panggunaan anu kaleuleuwihi sareng kaleuleuwihi gumantung kana fungisida tiasa nyababkeun munculna galur S. sclerotiorum anu tahan sareng mangaruhan négatif organisme non-target, kaséhatan taneuh, sareng kualitas cai (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Ku alatan éta, milarian alternatif anu ramah lingkungan parantos janten prioritas utama.
Poliamina (PA), sapertos putrescine, spermidine, spermine, sareng cadaverine, tiasa janten alternatif anu ngajangjikeun ngalawan patogén pepelakan anu ditularkan ku taneuh, ku kituna ngirangan sacara lengkep atanapi sabagian panggunaan fungisida kimia anu bahaya (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Dina pepelakan anu langkung luhur, PA kalibet dina seueur prosés fisiologis kalebet, tapi henteu diwatesan ku, pambagian sél, diferensiasi, sareng réspon kana setrés abiotik sareng biotik (Killiny sareng Nehela, 2020). Éta tiasa bertindak salaku antioksidan, ngabantosan ngabersihkeun spésiés oksigén réaktif (ROS), ngajaga homeostasis rédoks (Nehela sareng Killiny, 2023), ngainduksi gén anu aya hubunganana sareng pertahanan (Romero et al., 2018), ngatur rupa-rupa jalur métabolik (Nehela sareng Killiny, 2023), ngamodulasi fitohormon éndogén (Nehela sareng Killiny, 2019), ngadegkeun résistansi anu didapat sistemik (SAR), sareng ngatur interaksi patogén-tutuwuhan (Nehela sareng Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Perlu dicatet yén mékanisme sareng peran spésifik PA dina pertahanan tutuwuhan rupa-rupa gumantung kana spésiés tutuwuhan, patogén, sareng kaayaan lingkungan. PA anu paling loba dina tutuwuhan dibiosintésis tina poliamina L-ornitin ésénsial (Killiny sareng Nehela, 2020).
L-ornitin maénkeun sababaraha peran dina kamekaran sareng kamekaran pepelakan. Salaku conto, panilitian sateuacana nunjukkeun yén dina béas (Oryza sativa), ornitin tiasa aya hubunganana sareng daur ulang nitrogén (Liu et al., 2018), hasil béas, kualitas sareng aroma (Lu et al., 2020), sareng réspon setrés cai (Yang et al., 2000). Salajengna, aplikasi éksogén L-ornitin sacara signifikan ningkatkeun toleransi halodo dina bit gula (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) sareng ngirangan setrés uyah dina bawang (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu sareng Çavuşoǧlu, 2021) sareng pepelakan mété (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Peran poténsial L-ornitin dina pertahanan setrés abiotik tiasa disababkeun ku kalibetna dina akumulasi prolin dina pepelakan anu dirawat. Contona, gén anu aya patalina jeung métabolisme prolin, sapertos gén ornitin delta aminotransferase (delta-OAT) sareng prolin dehidrogenase (ProDH1 sareng ProDH2), sateuacanna parantos dilaporkeun kalibet dina pertahanan Nicotiana benthamiana sareng Arabidopsis thaliana ngalawan galur Pseudomonas syringae non-host (Senthil-Kumar sareng Mysore, 2012). Di sisi anu sanésna, jamur ornitin dekarboksilase (ODC) diperyogikeun pikeun kamekaran patogén (Singh et al., 2020). Nargetkeun ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ngalangkungan panyingkiran gén anu diinduksi ku host (HIGS) sacara signifikan ningkatkeun résistansi pepelakan tomat kana layu Fusarium (Singh et al., 2020). Nanging, peran poténsial aplikasi ornitin éksogén ngalawan setrés biotik sapertos fitopatogen tacan ditalungtik kalayan saé. Anu langkung penting, pangaruh ornitin kana résistansi panyakit sareng fénoména biokimia sareng fisiologis anu aya hubunganana masih seueur anu teu acan ditalungtik.
Ngartos kompleksitas inféksi S. sclerotiorum dina kacang-kacangan penting pikeun pamekaran strategi kontrol anu efektif. Dina panilitian ieu, tujuan kami nyaéta pikeun ngaidentipikasi peran poténsial diamina L-ornitin salaku faktor konci dina ningkatkeun mékanisme pertahanan sareng résistansi pepelakan kacang-kacangan kana inféksi Sclerotinia sclerotiorum. Kami ngaduga yén, salian ti ningkatkeun réspon pertahanan pepelakan anu kainféksi, L-ornitin ogé maénkeun peran konci dina ngajaga status rédoks. Kami ngajukeun yén pangaruh poténsial L-ornitin aya hubunganana sareng pangaturan mékanisme pertahanan antioksidan énzimatik sareng non-énzimatik sareng gangguan kana faktor patogénisitas/virulénsi jamur sareng protéin anu aya hubunganana. Fungsi ganda L-ornitin ieu ngajantenkeun calon anu ngajangjikeun pikeun strategi anu lestari pikeun ngirangan dampak kapang bodas sareng ningkatkeun résistansi pepelakan kacang-kacangan umum kana patogén jamur anu kuat ieu. Hasil panilitian ayeuna tiasa ngabantosan dina pamekaran metode inovatif sareng ramah lingkungan pikeun ngontrol kapang bodas sareng ngirangan dampakna kana produksi kacang-kacangan.
Dina ieu panilitian, variétas komérsial kacang umum anu rentan, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), dianggo salaku bahan ékspérimén. Siki anu séhat disayogikeun ku Departemen Panalungtikan Kacang-kacangan, Institut Panalungtikan Tanaman Lapangan (FCRI), Pusat Panalungtikan Pertanian (ARC), Mesir. Lima siki dipelak dina pot plastik (diaméter jero 35 cm, jerona 50 cm) anu dieusi taneuh anu kainféksi S. sclerotiorum dina kaayaan rumah kaca (25 ± 2 °C, kalembaban relatif 75 ± 1%, 8 jam caang / 16 jam poék). Dina 7–10 dinten saatos dipelak (DPS), bibit diipiskeun pikeun nyésakeun ngan dua bibit anu tumuwuh seragam sareng tilu daun anu mekar pinuh dina unggal pot. Sadaya pepelakan dina pot disiram unggal dua minggu sakali sareng dipupuk unggal bulan dina tingkat anu disarankeun pikeun variétas anu dipasihkeun.
Pikeun nyiapkeun konsentrasi 500 mg/L L-ornitindiamina (ogé katelah asam (+)-(S)-2,5-diaminopentanoat; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman), 50 mg mimitina dileyurkeun dina 100 mL cai sulingan steril. Larutan stok teras diéncérkeun sareng dianggo dina ékspérimén salajengna. Sacara singget, genep séri konsentrasi L-ornitin (12,5, 25, 50, 75, 100, sareng 125 mg/L) diuji sacara in vitro. Salian ti éta, cai sulingan steril dianggo salaku kontrol négatif (Mock) sareng fungisida komérsial "Rizolex-T" bubuk baseuh 50% (toclofos-metil 20% + thiram 30%; Perusahaan Pestisida sareng Bahan Kimia KZ-Kafr El Zayat, Kafr El Zayat, Gubernur Gharbia, Mesir) dianggo salaku kontrol positif. Fungisida komérsial “Rizolex-T” diuji sacara in vitro dina lima konsentrasi (2, 4, 6, 8 sareng 10 mg/L).
Sampel gagang jeung polong kacang umum anu némbongkeun gejala has kapang bodas (tingkat inféstasi: 10–30%) dikumpulkeun ti kebon komérsial. Sanaos kalolobaan bahan pepelakan anu kainféksi diidéntifikasi dumasar spésiés/variétas (variétas komérsial anu rentan Giza 3), anu sanésna, khususna anu diala ti pasar lokal, asalna tina spésiés anu teu dipikanyaho. Bahan anu kainféksi anu dikumpulkeun mimitina didisinféksi permukaan ku larutan natrium hipoklorit 0,5% salami 3 menit, teras dibilas sababaraha kali ku cai sulingan steril sareng diusap dugi ka garing ku kertas saring steril pikeun miceun kaleuwihan cai. Organ anu kainféksi teras dipotong-potong leutik tina jaringan tengah (antara jaringan séhat sareng jaringan anu kainféksi), dibudidayakeun dina média agar dekstrosa kentang (PDA) sareng diinkubasi dina suhu 25 ± 2 °C kalayan siklus cahaya 12 jam/poék 12 jam salami 5 dinten pikeun ngarangsang formasi sklerotia. Métode ujung miselium ogé dianggo pikeun ngamurnikeun isolat jamur tina kultur campuran atanapi anu kacemar. Isolat jamur anu dimurnikeun mimitina diidéntifikasi dumasar kana karakteristik morfologis budayana teras dikonfirmasi janten S. sclerotiorum dumasar kana fitur mikroskopis. Pamungkas, sadaya isolat anu dimurnikeun diuji patogénisitas dina kultivar kacang umum Giza 3 anu rentan pikeun minuhan postulat Koch.
Salian ti éta, isolat S. sclerotiorum anu paling invasif (isolat #3) salajengna dikonfirmasi dumasar kana sekuensing spacer transkripsi internal (ITS) sakumaha anu dijelaskeun ku White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Sacara singget, isolat dibudidayakeun dina kaldu dekstrosa kentang (PDB) sareng diinkubasi dina suhu 25 ± 2 °C salami 5–7 dinten. Miselium jamur teras dikumpulkeun, disaring nganggo lawon katun, dikumbah dua kali nganggo cai steril, sareng dikeringkeun nganggo kertas saring steril. DNA genomik diisolasi nganggo Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Daérah rDNA ITS teras diamplifikasi nganggo pasangan primer khusus ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ukuran anu dipiharep: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Produk PCR anu dimurnikeun dikintunkeun pikeun sekuensing (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sekuen rDNA ITS diurutkeun sacara dua arah nganggo metode sekuensing Sanger. Sekuen pamundut anu dirakit teras dibandingkeun sareng data pangénggalna di GenBank sareng Pusat Nasional pikeun Inpormasi Biotéhnologi (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) nganggo parangkat lunak BLASTn. Sekuen pamundut dibandingkeun sareng 20 galur/isolat S. sclerotiorum sanés anu dicandak tina data pangénggalna di NCBI GenBank (Tabel Tambahan S1) nganggo ClustalW dina Paket Analisis Genetika Évolusi Molekuler (MEGA-11; vérsi 11) (Kumar et al., 2024). Analisis évolusionér dilakukeun nganggo metode kamungkinan maksimum sareng modél substitusi nukléotida anu tiasa dibalikkeun sacara umum (Nei sareng Kumar, 2000). Tangkal anu gaduh kamungkinan log pangluhurna dipidangkeun. Tangkal awal pikeun panéangan heuristik dipilih ku cara milih tangkal anu gaduh kamungkinan log anu langkung luhur antara tangkal anu ngagabung sareng tatangga (NJ) (Kumar et al., 2024) sareng tangkal parsimony maksimum (MP). Tangkal NJ diwangun nganggo matriks jarak berpasangan anu diitung nganggo modél anu tiasa dibalikkeun sacara umum (Nei sareng Kumar, 2000).
Aktivitas antibakteri L-ornitin sareng baktérisida "Rizolex-T" ditangtukeun sacara in vitro ku metode difusi agar. Métode: Candak jumlah larutan stok L-ornitin (500 mg/L) anu pas teras campur rata sareng 10 ml média nutrisi PDA pikeun nyiapkeun larutan kalayan konsentrasi ahir 12,5, 25, 50, 75, 100 sareng 125 mg/L, masing-masing. Lima konsentrasi fungisida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 sareng 10 mg/L) sareng cai sulingan steril dianggo salaku kontrol. Saatos média padet, colokan miselium anu nembé disiapkeun tina kultur Sclerotinia sclerotiorum, diaméter 4 mm, dipindahkeun ka tengah cawan Petri sareng dibudidayakeun dina suhu 25±2°C dugi ka miselium nutupan sakumna cawan Petri kontrol, saatos éta kamekaran jamur dicatet. Hitung persentase inhibisi kamekaran radial S. sclerotiorum nganggo persamaan 1:
Ékspérimén ieu diulang dua kali, kalayan genep réplikasi biologis pikeun unggal kelompok kontrol/ékspériméntal sareng lima pot (dua pepelakan per pot) pikeun unggal réplikasi biologis. Unggal réplikasi biologis dianalisis dua kali (dua réplikasi téknis) pikeun mastikeun akurasi, reliabilitas, sareng réproduktibilitas hasil ékspériméntal. Salian ti éta, analisis régrési probit dianggo pikeun ngitung konsentrasi inhibisi satengah maksimal (IC50) sareng IC99 (Prentice, 1976).
Pikeun meunteun poténsi L-ornitin dina kaayaan rumah kaca, dua ékspérimén pot anu padeukeut dilaksanakeun. Sacara singget, pot dieusi ku taneuh liat-keusik anu disterilisasi (3:1) sareng diinokulasi ku kultur S. sclerotiorum anu nembé disiapkeun. Mimitina, isolat S. sclerotiorum anu paling invasif (isolat #3) dibudidayakeun ku cara motong hiji sclerotium jadi satengah, nempatkeun éta nyanghareup ka handap dina PDA sareng diinkubasi dina suhu 25°C dina poék anu konstan (24 jam) salami 4 dinten pikeun ngarangsang kamekaran miselium. Opat colokan agar diaméter 5 mm teras dicandak tina ujung payun sareng diinokulasi ku 100 g campuran steril gandum sareng dedak béas (1:1, v/v) sareng sadaya labu diinkubasi dina suhu 25 ± 2 °C dina siklus cahaya 12 jam/poék 12 jam salami 5 dinten pikeun ngarangsang formasi sclerotia. Eusi sadaya labu dicampur tuntas pikeun mastikeun homogenitas sateuacan nambihan taneuh. Teras, 100 g campuran dedak anu ngajajah ditambahkeun kana unggal pot pikeun mastikeun konsentrasi patogén anu konstan. Pot anu diinokulasi disiram pikeun ngaktipkeun kamekaran jamur sareng disimpen dina kaayaan rumah kaca salami 7 dinten.
Lima siki variétas Giza 3 teras dipelak dina unggal pot. Pikeun pot anu dirawat ku L-ornithine sareng fungisida Rizolex-T, siki anu disterilisasi mimitina direndem salami dua jam dina larutan cai tina dua sanyawa kalayan konsentrasi IC99 ahir masing-masing sakitar 250 mg/L sareng 50 mg/L, teras dikeringkeun salami sajam sateuacan dipelak. Di sisi anu sanés, siki direndem dina cai sulingan steril salaku kontrol négatif. Saatos 10 dinten, sateuacan disiram heula, bibit diencerkeun, ngan ukur nyésakeun dua bibit anu rapih dina unggal pot. Salaku tambahan, pikeun mastikeun inféksi ku S. sclerotiorum, batang pepelakan kacang dina tahap perkembangan anu sami (10 dinten) dipotong di dua lokasi anu béda nganggo pisau bedah anu disterilisasi sareng sakitar 0,5 g campuran dedak kolonisasi disimpen kana unggal tatu, dituturkeun ku kalembaban anu luhur pikeun ngarangsang inféksi sareng perkembangan panyakit dina sadaya pepelakan anu diinokulasi. Tutuwuhan kontrol ogé dicabik-cabik sacara sarua sarta jumlah anu sarua (0,5 g) campuran dedak steril anu teu dikolonisasi diasupkeun kana tatu sarta dijaga dina kalembaban anu luhur pikeun nyimulasikeun lingkungan pikeun kamekaran panyakit sarta mastikeun konsistensi antara kelompok perlakuan.
Métode pangobatan: Bibit kacang disiram ku 500 ml larutan cai L-ornitin (250 mg/l) atanapi fungisida Rizolex-T (50 mg/l) ku cara ngairigasi taneuh, teras pangobatan diulang tilu kali kalayan interval 10 dinten. Kontrol anu dirawat plasebo disiram ku 500 ml cai sulingan steril. Sadaya pangobatan dilaksanakeun dina kaayaan rumah kaca (25 ± 2°C, kalembaban relatif 75 ± 1%, sareng fotoperiode 8 jam caang / 16 jam poék). Sadaya pot disiram dua minggu sakali sareng dirawat unggal bulan ku pupuk NPK anu saimbang (20-20-20, kalayan 3,6% walirang sareng unsur mikro TE; Zain Seeds, Mesir) dina konsentrasi 3–4 g/l ku cara nyemprot daun numutkeun rekomendasi pikeun variétas khusus sareng pitunjuk produsén. Kajaba disebutkeun béda, daun dewasa anu geus mekar sapinuhna (daun ka-2 jeung ka-3 ti luhur) dikumpulkeun ti unggal réplikasi biologis dina 72 jam pasca-perlakuan (hpt), dihomogenisasi, dikumpulkeun, jeung disimpen dina suhu -80 °C pikeun analisis salajengna kaasup, tapi teu diwatesan ku, lokalisasi histokimia in situ tina indikator setrés oksidatif, peroksidasi lipid, antioksidan énzimatik jeung non-énzimatik, sarta éksprési gén.
Inténsitas inféksi kapang bodas dipeunteun mingguan 21 dinten saatos inokulasi (dpi) nganggo skala 1–9 (Tabel Tambahan S2) dumasar kana skala Petzoldt sareng Dickson (1996) anu dirobih ku Teran et al. (2006). Sacara singget, batang sareng dahan pepelakan kacang dipariksa dimimitian ti titik inokulasi pikeun nuturkeun kamajuan lési sapanjang internode sareng simpul. Jarak lési ti titik inokulasi ka titik pangjauhna sapanjang batang atanapi dahan teras diukur sareng skor 1–9 ditugaskeun dumasar kana lokasi lési, dimana (1) nunjukkeun teu aya inféksi anu katingali caket titik inokulasi sareng (2–9) nunjukkeun paningkatan laun dina ukuran lési sareng kamajuan sapanjang simpul/internode (Tabel Tambahan S2). Inténsitas inféksi kapang bodas teras dirobih kana persentase nganggo rumus 2:
Salian ti éta, daérah di handapeun kurva kamajuan panyakit (AUDPC) diitung nganggo rumus (Shaner sareng Finney, 1977), anu nembe diadaptasi pikeun busuk bodas kacang buncis (Chauhan et al., 2020) nganggo persamaan 3:
Di mana Yi = parahna panyakit dina waktos ti, Yi+1 = parahna panyakit dina waktos salajengna ti+1, ti = waktos pangukuran munggaran (dina dinten), ti+1 = waktos pangukuran salajengna (dina dinten), n = jumlah total titik waktos atanapi titik observasi. Parameter kamekaran pepelakan buncis kalebet jangkungna pepelakan (cm), jumlah dahan per pepelakan, sareng jumlah daun per pepelakan dirékam mingguan salami 21 dinten dina sadaya ulangan biologis.
Dina unggal réplikasi biologis, sampel daun (daun kadua sareng katilu anu parantos mekar pinuh ti luhur) dikumpulkeun dina dinten ka-45 saatos perlakuan (15 dinten saatos perlakuan terakhir). Unggal réplikasi biologis diwangun ku lima pot (dua pepelakan per pot). Sakitar 500 mg jaringan anu ditumbuk dianggo pikeun ékstraksi pigmén fotosintésis (klorofil a, klorofil b sareng karotenoid) nganggo 80% aseton dina suhu 4 °C dina poék. Saatos 24 jam, sampel disentrifugasi sareng supernatan dikumpulkeun pikeun nangtukeun eusi klorofil a, klorofil b sareng karotenoid sacara kolorimetri nganggo spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang) numutkeun metode (Lichtenthaler, 1987) ku cara ngukur absorbansi dina tilu panjang gelombang anu béda (A470, A646 sareng A663 nm). Pamungkas, eusi pigmén fotosintésis diitung nganggo rumus 4–6 ieu anu dijelaskeun ku Lichtenthaler (1987).
Dina 72 jam saatos perlakuan (hpt), daun (daun kadua sareng katilu anu parantos mekar pinuh ti luhur) dikumpulkeun tina unggal réplikasi biologis pikeun lokalisasi histokimia in situ hidrogén péroksida (H2O2) sareng anion superoksida (O2•−). Unggal réplikasi biologis diwangun ku lima pot (dua pepelakan per pot). Unggal réplikasi biologis dianalisis dina duplikat (dua réplikasi téknis) pikeun mastikeun akurasi, reliabilitas sareng réproduksibilitas metode. H2O2 sareng O2•− ditangtukeun nganggo 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) atanapi nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman), masing-masing, nuturkeun metode anu dijelaskeun ku Romero-Puertas et al. (2004) sareng Adam et al. (1989) kalayan modifikasi minor. Pikeun lokalisasi histokimia H2O2 in situ, leaflet diinfus sacara vakum ku 0,1% DAB dina 10 mM buffer Tris (pH 7,8) teras diinkubasi dina suhu kamar dina cahaya salami 60 menit. Leaflet diputihan dina 0,15% (v/v) TCA dina 4:1 (v/v) étanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir) teras dipapaésan kana cahaya dugi ka poék. Sarua kitu, klep diinfus sacara vakum ku 10 mM buffer kalium fosfat (pH 7,8) anu ngandung 0,1 w/v % HBT pikeun lokalisasi histokimia O2•− in situ. Leaflet diinkubasi dina cahaya dina suhu kamar salami 20 menit, teras diputihan sapertos di luhur, teras disinari dugi ka bintik biru/ungu poék muncul. Inténsitas warna coklat (salaku indikator H2O2) atanapi biru-ungu (salaku indikator O2•−) anu dihasilkeun dipeunteun nganggo vérsi Fiji tina pakét pamrosésan gambar ImageJ (http://fiji.sc; diaksés 7 Maret 2024).
Malondialdehida (MDA; salaku pananda peroksidasi lipid) ditangtukeun dumasar kana metode Du sareng Bramlage (1992) kalayan modifikasi sakedik. Daun tina unggal réplikasi biologis (daun kadua sareng katilu anu dimekarkeun pinuh ti luhur) dikumpulkeun 72 jam saatos perlakuan (hpt). Unggal réplikasi biologis ngawengku lima pot (dua pepelakan per pot). Unggal réplikasi biologis dianalisis dina duplikat (dua réplikasi téknis) pikeun mastikeun akurasi, reliabilitas sareng réproduksibilitas metode. Sacara singget, 0,5 g jaringan daun anu ditumbuk dianggo pikeun ékstraksi MDA kalayan 20% asam trikloroasetat (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, AS) anu ngandung 0,01% butil hidroksitoluén (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS). Eusi MDA dina supernatan teras ditangtukeun sacara kolorimetri ku cara ngukur absorbansi dina 532 sareng 600 nm nganggo spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang) teras dinyatakeun salaku nmol g−1 FW.
Pikeun panilaian antioksidan non-énzimatik sareng énzimatik, daun (daun kadua sareng katilu anu parantos mekar pinuh ti luhur) dikumpulkeun tina unggal réplikasi biologis dina 72 jam saatos perlakuan (hpt). Unggal réplikasi biologis diwangun ku lima pot (dua pepelakan per pot). Unggal sampel biologis dianalisis dina dua kali lipat (dua sampel téknis). Dua daun digiling ku nitrogén cair sareng dianggo langsung pikeun nangtukeun antioksidan énzimatik sareng non-énzimatik, total asam amino, eusi prolin, éksprési gén, sareng kuantifikasi oksalat.
Total fenolik anu leyur ditangtukeun nganggo réagen Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kalayan modifikasi sakedik tina metode anu dijelaskeun ku Kahkonen et al. (1999). Sacara singget, sakitar 0,1 g jaringan daun anu dihomogenisasi diekstrak ku 20 ml metanol 80% dina poék salami 24 jam sareng supernatan dikumpulkeun saatos sentrifugasi. 0,1 ml ekstrak sampel dicampur sareng 0,5 ml réagen Folin-Ciocalteu (10%), dikocok salami 30 detik sareng di tinggalkeun dina poék salami 5 menit. Teras 0,5 ml larutan natrium karbonat 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Mesir) ditambahkeun kana unggal tabung, dicampur rata sareng diinkubasi dina suhu kamar dina poék salami 1 jam. Saatos inkubasi, absorbansi campuran réaksi diukur dina 765 nm nganggo spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Konsentrasi fenol leyur total dina ekstrak sampel ditangtukeun nganggo kurva kalibrasi asam galat (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) sareng dinyatakeun salaku miligram sarimbag asam galat per gram beurat seger (mg GAE g-1 beurat seger).
Kandungan flavonoid leyur total ditangtukeun dumasar kana metode Djeridane et al. (2006) kalayan modifikasi sakedik. Sacara singget, 0,3 ml ekstrak metanol di luhur dicampur sareng 0,3 ml larutan aluminium klorida 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), diaduk kalayan kuat teras diinkubasi dina suhu kamar salami 5 menit, dituturkeun ku panambahan 0,3 ml larutan kalium asetat 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir), dicampur tuntas teras diinkubasi dina suhu kamar salami 30 menit dina poék. Saatos inkubasi, absorbansi campuran réaksi diukur dina 430 nm nganggo spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Konsentrasi flavonoid leyur total dina ekstrak sampel ditangtukeun nganggo kurva kalibrasi rutin (TCI America, Portland, OR, USA) teras dinyatakeun salaku miligram sarimbag rutin per gram beurat seger (mg RE g-1 beurat seger).
Kandungan asam amino bébas total dina daun buncis ditangtukeun nganggo réagen ninhidrin anu dimodifikasi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) dumasar kana metode anu diusulkeun ku Yokoyama sareng Hiramatsu (2003) sareng dimodifikasi ku Sun et al. (2006). Sacara singget, 0,1 g jaringan anu digiling diekstrak nganggo buffer pH 5,4, sareng 200 μL supernatan diréaksikeun sareng 200 μL ninhidrin (2%) sareng 200 μL piridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), diinkubasi dina cai anu ngagolak salami 30 menit, teras didinginkan sareng diukur dina 580 nm nganggo spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Di sisi anu sanésna, prolin ditangtukeun ku metode Bates (Bates et al., 1973). Prolin diekstrak ku asam sulfosalicylic 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) sareng saatos sentrifugasi, 0,5 ml supernatan dicampur sareng 1 ml asam asetat glasial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) sareng réagen ninhidrin, diinkubasi dina suhu 90°C salami 45 menit, didinginkan sareng diukur dina 520 nm nganggo spektrofotometer anu sami sareng di luhur. Total asam amino bébas sareng prolin dina ekstrak daun ditangtukeun nganggo kurva kalibrasi glisin sareng prolin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), masing-masing, sareng dinyatakeun salaku mg/g beurat seger.
Pikeun nangtukeun aktivitas énzimatik énzim antioksidan, sakitar 500 mg jaringan anu dihomogenisasi diekstrak nganggo 3 ml 50 mM buffer Tris (pH 7,8) anu ngandung 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sareng 7,5% polivinilpirolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), disentrifugasi dina 10.000 × g salami 20 menit dina kulkas (4 °C), sareng supernatan (ekstrak énzim kasar) dikumpulkeun (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) teras diréaksikeun sareng 2 ml buffer natrium fosfat 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sareng 100 μl larutan H2O2 269 mM pikeun nangtukeun aktivitas énzimatikna numutkeun metode Aebi (1984) kalayan modifikasi sakedik (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Aktivitas énzimatik peroksidase anu gumantung kana guaiacol (POX) ditangtukeun nganggo metode Harrach et al. (2009). (2008) kalayan modifikasi minor (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) sareng aktivitas énzimatik polifenol oksidase (PPO) ditangtukeun saatos réaksi sareng 2,2 ml 100 mM buffer natrium fosfat (pH 6,0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) sareng 100 μl 12 mM H2O2. Métode ieu rada dirobih tina (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Uji ieu dilaksanakeun saatos réaksi sareng 3 ml larutan katekol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) anu nembé disiapkeun dina 0,1 M buffer fosfat (pH 6,0). Aktivitas CAT diukur ku cara ngawaskeun dékomposisi H2O2 dina 240 nm (A240), aktivitas POX diukur ku cara ngawaskeun paningkatan absorbansi dina 436 nm (A436), sareng aktivitas PPO diukur ku cara ngarékam fluktuasi absorbansi dina 495 nm (A495) unggal 30 detik salami 3 menit nganggo spektrofotometer UV-160A (Shimadzu, Jepang).
RT-PCR real-time dianggo pikeun ngadeteksi tingkat transkrip tina tilu gén anu aya hubunganana sareng antioksidan, kalebet katalase peroksisomal (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoksida dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), sareng glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), dina daun kacang (daun kadua sareng katilu anu dimekarkeun pinuh ti luhur) 72 jam saatos perlakuan terakhir. Sacara singget, RNA diisolasi nganggo Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Cina) numutkeun protokol produsén. Teras, cDNA disintésis nganggo TOP script™ cDNA Synthesis Kit numutkeun pitunjuk produsén. Urutan primer tina tilu gén di luhur didaptarkeun dina Tabel Tambahan S3. PvActin-3 (nomer aksési GenBank: XM_068616709.1) dianggo salaku gén pangurus sareng éksprési gén relatif diitung nganggo metode 2-ΔΔCT (Livak sareng Schmittgen, 2001). Stabilitas aktin dina setrés biotik (interaksi anu teu cocog antara kacang-kacangan umum sareng jamur antraknosa Colletotrichum lindemuthianum) sareng setrés abiotik (halodo, salinitas, suhu handap) parantos dipidangkeun (Borges et al., 2012).
Mimitina kami ngalaksanakeun analisis in silico sakumna génom tina protéin oksaloasetat asetilhidrolase (OAH) dina S. sclerotiorum nganggo alat BLAST protéin-protéin (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Sacara singget, kami nganggo OAH tina Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; nomer aksés GenBank XP_040799428.1; 342 asam amino) sareng Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; nomer aksés GenBank XP_056833920.1; 316 asam amino) salaku runtuyan pamundut pikeun memetakan protéin homolog dina S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp dilaksanakeun ngalawan data génom S. sclerotiorum anu pangénggalna sayogi dina GenBank dina situs wéb Pusat Nasional pikeun Inpormasi Biotéhnologi (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Salian ti éta, gén OAH anu diprediksi ti S. sclerotiorum (SsOAH) sareng analisis évolusionér sareng tangkal filogenetik AfOAH ti A. fijiensis CBS 313.89 sareng PlOAH ti P. lagena disimpulkeun nganggo metode likelihood maksimum dina MEGA11 (Tamura et al., 2021) sareng modél berbasis matriks JTT (Jones et al., 1992). Tangkal filogenetik digabungkeun sareng analisis alignment ganda tina runtuyan protéin sadaya gén OAH anu diprediksi (SsOAH) ti S. sclerotiorum sareng runtuyan pamundut nganggo Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos sareng Agarwala, 2007). Salian ti éta, runtuyan asam amino SsOAH anu paling cocog ti S. sclerotiorum diluyukeun jeung runtuyan pamundut (AfOAH jeung PlOAH) (Larkin et al., 2007) maké ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), sarta wewengkon anu dilestarikan dina panyelarasan divisualisasikeun maké alat ESPript (versi 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Salajengna, domain répréséntatif fungsional anu diprediksi sareng situs anu dilestarikan tina S. sclerotiorum SsOAH sacara interaktif diklasifikasikeun kana kulawarga anu béda nganggo alat InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Pamungkas, modél struktur tilu diménsi (3D) tina S. sclerotiorum SsOAH anu diprediksi dilakukeun nganggo Protein Homology/Analogy Recognition Engine (server Phyre2 versi 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) sareng divalidasi nganggo server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Struktur tilu diménsi anu diprediksi (format PDB) divisualisasikeun sacara interaktif nganggo pakét UCSF-Chimera (versi 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
PCR fluoresensi real-time kuantitatif dianggo pikeun nangtukeun tingkat transkripsi oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH; nomer aksés GenBank: XM_001590428.1) dina miselium Sclerotinia sclerotiorum. Sacara singget, S. sclerotiorum diinokulasi kana labu anu ngandung PDB sareng disimpen dina inkubator anu dikocok (modél: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) dina suhu 25 ± 2 °C salami 24 jam dina 150 rpm sareng dina poék anu konstan (24 jam) pikeun ngarangsang kamekaran miselium. Saatos éta, sél-sél dirawat ku L-ornitin sareng fungisida Rizolex-T dina konsentrasi IC50 ahir (masing-masing sakitar 40 sareng 3,2 mg/L) teras dikultur salami 24 jam deui dina kaayaan anu sami. Saatos inkubasi, kultur disentrifugasi dina 2500 rpm salami 5 menit sareng supernatan (miselium jamur) dikumpulkeun pikeun analisis éksprési gén. Nya kitu, miselium jamur dikumpulkeun dina 0, 24, 48, 72, 96, sareng 120 jam pasca-inféksi tina pepelakan anu kainféksi anu parantos ngabentuk kapang bodas sareng miselium kapas dina permukaan jaringan anu kainféksi. RNA diekstrak tina miselium jamur teras cDNA disintésis sapertos anu dijelaskeun di luhur. Urutan primer pikeun SsOAH didaptarkeun dina Tabel Tambahan S3. SsActin (nomer aksési GenBank: XM_001589919.1) dianggo salaku gén pangurus, sareng éksprési gén relatif diitung nganggo metode 2-ΔΔCT (Livak sareng Schmittgen, 2001).
Asam oksalat ditangtukeun dina kaldu dekstrosa kentang (PDB) sareng sampel pepelakan anu ngandung patogén jamur Sclerotinia sclerotiorum numutkeun metode Xu sareng Zhang (2000) kalayan modifikasi sakedik. Sacara singget, isolat S. sclerotiorum diinokulasi kana labu anu ngandung PDB teras dibudidayakeun dina inkubator anu dikocok (modél I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) dina 150 rpm dina 25 ± 2 °C salami 3–5 dinten dina poék anu konstan (24 jam) pikeun ngarangsang kamekaran miselium. Saatos inkubasi, kultur jamur mimitina disaring ngalangkungan kertas saring Whatman #1 teras disentrifugasi dina 2500 rpm salami 5 menit pikeun miceun sésa miselium. Supernatan dikumpulkeun sareng disimpen dina suhu 4°C pikeun nangtukeun kuantitatif oksalat salajengna. Pikeun persiapan sampel pepelakan, sakitar 0,1 g fragmen jaringan pepelakan diekstrak tilu kali nganggo cai sulingan (2 ml unggal waktos). Sampel teras disentrifugasi dina 2500 rpm salami 5 menit, supernatan disaring garing nganggo kertas saring Whatman No. 1 sareng dikumpulkeun pikeun dianalisis salajengna.
Pikeun analisis kuantitatif asam oksalat, campuran réaksi disiapkeun dina tabung kaca anu ditutup ku sumbat dina urutan ieu: 0,2 ml sampel (atanapi filtrat kultur PDB atanapi larutan standar asam oksalat), 0,11 ml bromofenol biru (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml asam sulfat 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Mesir) sareng 0,176 ml 100 mM kalium dikromat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), teras larutan éta diéncérkeun janten 4,8 ml ku cai sulingan, dicampur kalayan kuat sareng langsung disimpen dina bak cai 60 °C. Saatos 10 menit, réaksi dieureunkeun ku nambihan 0,5 ml larutan natrium hidroksida (NaOH; 0,75 M). Absorbansi (A600) tina campuran réaksi diukur dina 600 nm nganggo spektrofotometer UV-160 (Shimadzu Corporation, Jepang). PDB sareng cai sulingan dianggo salaku kontrol pikeun kuantifikasi filtrat kultur sareng sampel pepelakan. Konsentrasi asam oksalat dina filtrat kultur, dinyatakeun salaku mikrogram asam oksalat per mililiter média PDB (μg.mL−1), sareng dina ekstrak daun, dinyatakeun salaku mikrogram asam oksalat per gram beurat seger (μg.g−1 FW), ditangtukeun nganggo kurva kalibrasi asam oksalat (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Sapanjang panilitian, sadaya ékspérimén dirancang dina desain acak lengkep (CRD) kalayan genep ulangan biologis per perlakuan sareng lima pot per ulangan biologis (dua pepelakan per pot) kecuali upami dinyatakeun sanés. Réplikasi biologis dianalisis dina duplikat (dua ulangan téknis). Réplikasi téknis dianggo pikeun mariksa réproduktibilitas ékspérimén anu sami tapi henteu dianggo dina analisis statistik pikeun nyingkahan ulangan palsu. Data dianalisis sacara statistik nganggo analisis varian (ANOVA) dituturkeun ku uji béda anu signifikan sacara jujur ​​​​(HSD) Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Pikeun ékspérimén in vitro, nilai IC50 sareng IC99 diitung nganggo modél probit sareng interval kapercayaan 95% diitung.
Aya opat isolat anu dikumpulkeun ti kebon kacang kedelai anu béda-béda di Gubernur El Ghabiya, Mesir. Dina média PDA, sadaya isolat ngahasilkeun miselium bodas krem ​​anu gancang robah jadi bodas kapas (Gambar 1A) teras beige atanapi coklat dina tahap sklerotium. Sklerotia biasana padet, hideung, buleud atanapi bentukna henteu teratur, panjangna 5,2 dugi ka 7,7 mm sareng diaméterna 3,4 dugi ka 5,3 mm (Gambar 1B). Sanaos opat isolat ngembangkeun pola sklerotia marginal di sisi média kultur saatos 10-12 dinten inkubasi dina suhu 25 ± 2 °C (Gambar 1A), jumlah sklerotia per piring béda sacara signifikan di antara aranjeunna (P < 0,001), kalayan isolat 3 ngagaduhan jumlah sklerotia pangluhurna (32,33 ± 1,53 sklerotia per piring; Gambar 1C). Sarua kitu, isolat #3 ngahasilkeun asam oksalat anu langkung seueur dina PDB tibatan isolat anu sanés (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Gambar 1D). Isolat #3 nunjukkeun ciri morfologis sareng mikroskopis anu khas tina jamur fitopatogén Sclerotinia sclerotiorum. Salaku conto, dina PDA, koloni isolat #3 tumuwuh gancang, bodas krem ​​(Gambar 1A), beige tibalik atanapi konéng-coklat salmon ngora, sareng peryogi 6-7 dinten dina suhu 25 ± 2°C pikeun nutupan sapinuhna permukaan pelat diaméter 9 cm. Dumasar kana ciri morfologis sareng mikroskopis di luhur, isolat #3 diidéntifikasi salaku Sclerotinia sclerotiorum.
Gambar 1. Ciri-ciri sareng patogénisitas isolat S. sclerotiorum tina pepelakan legum umum. (A) Tumuwuhna miselium tina opat isolat S. sclerotiorum dina média PDA, (B) sclerotia tina opat isolat S. sclerotiorum, (C) jumlah sclerotia (per piring), (D) sékrési asam oksalat dina média PDB (μg.mL−1), sareng (E) parahna panyakit (%) tina opat isolat S. sclerotiorum dina kultivar legum komérsial anu rentan Giza 3 dina kaayaan rumah kaca. Nilai ngagambarkeun rata-rata ± SD tina lima réplika biologis (n = 5). Hurup anu béda nunjukkeun béda anu signifikan sacara statistik antara perlakuan (p < 0,05). (F–H) Gejala kapang bodas anu has muncul dina batang sareng silique di luhur taneuh, masing-masing, 10 dinten saatos inokulasi ku isolat #3 (dpi). (I) Analisis évolusionér daérah spacer transkripsi internal (ITS) tina isolat S. sclerotiorum #3 dilaksanakeun nganggo metode kamungkinan maksimum sareng dibandingkeun sareng 20 isolat/galur rujukan anu diala tina database Pusat Nasional pikeun Inpormasi Biotéhnologi (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Angka-angka di luhur garis klaster nunjukkeun cakupan daérah (%), sareng angka-angka di handap garis klaster nunjukkeun panjang cabang.
Salajengna, pikeun mastikeun patogénisitasna, opat isolat S. sclerotiorum anu diala dianggo pikeun nginokulasi kultivar kacang komérsial Giza 3 anu rentan dina kaayaan rumah kaca, anu saluyu sareng postulat Koch (Gambar 1E). Sanaos sadaya isolat jamur anu diala patogén sareng tiasa ngainféksi kacang héjo (cv. Giza 3), nyababkeun gejala kapang bodas anu khas dina sadaya bagian di luhur taneuh (Gambar 1F), khususna dina batang (Gambar 1G) sareng polong (Gambar 1H) dina 10 dinten saatos inokulasi (dpi), isolat 3 mangrupikeun isolat anu paling agrésif dina dua ékspérimén mandiri. Isolat 3 ngagaduhan tingkat parah panyakit pangluhurna (%) dina pepelakan kacang (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, sareng 76,7 ± 3,1 dina 7, 14, sareng 21 dinten saatos inféksi, masing-masing; Gambar 1F).
Idéntifikasi isolat S. sclerotiorum #3 anu paling invasif salajengna dikonfirmasi dumasar kana sekuensing spacer transkripsi internal (ITS) (Gambar 1I). Analisis filogenetik antara isolat #3 sareng 20 isolat/galur rujukan nunjukkeun kamiripan anu luhur (>99%) di antara aranjeunna. Perlu dicatet yén isolat S. sclerotiorum #3 (533 bp) gaduh kamiripan anu luhur sareng isolat S. sclerotiorum Amérika LPM36 anu diisolasi tina siki kacang polong garing (nomer aksési GenBank MK896659.1; 540 bp) sareng isolat S. sclerotiorum Cina YKY211 (nomer aksési GenBank OR206374.1; 548 bp), anu nyababkeun busuk batang violet (Matthiola incana), anu sadayana dikelompokkeun sacara misah di luhur dendrogram (Gambar 1I). Urutan anyar ieu parantos disimpen dina database NCBI sareng dingaranan "Sclerotinia sclerotiorum - isolat YN-25" (nomer aksési GenBank PV202792). Katingali yén isolat 3 mangrupikeun isolat anu paling invasif; ku kituna, isolat ieu dipilih pikeun panilitian dina sadaya ékspérimén salajengna.
Aktivitas antibakteri tina diamina L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) dina konsentrasi anu béda (12,5, 25, 50, 75, 100 sareng 125 mg/L) ngalawan isolat S. sclerotiorum 3 parantos ditalungtik sacara in vitro. Perlu dicatet yén L-ornitin nunjukkeun pangaruh antibakteri sareng laun-laun ngahambat kamekaran radial hifa S. sclerotiorum sacara gumantung kana dosis (Gambar 2A, B). Dina konsentrasi pangluhurna anu diuji (125 mg/L), L-ornitin nunjukkeun laju inhibisi kamekaran miselium pangluhurna (99,62 ± 0,27%; Gambar 2B), anu sami sareng fungisida komérsial Rizolex-T (laju inhibisi 99,45 ± 0,39%; Gambar 2C) dina konsentrasi pangluhurna anu diuji (10 mg/L), nunjukkeun khasiat anu sami.
Gambar 2. Aktivitas antibakteri in vitro L-ornitin ngalawan Sclerotinia sclerotiorum. (A) Babandingan aktivitas antibakteri tina konsentrasi L-ornitin anu béda ngalawan S. sclerotiorum sareng fungisida komérsial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Laju inhibisi (%) kamekaran miselium S. sclerotiorum saatos perlakuan ku konsentrasi L-ornitin anu béda (12,5, 25, 50, 75, 100 sareng 125 mg/L) atanapi Rizolex-T (2, 4, 6, 8 sareng 10 mg/L), masing-masing. Nilai ngagambarkeun rata-rata ± SD tina lima réplika biologis (n = 5). Hurup anu béda nunjukkeun bédana statistik antara perlakuan (p < 0,05). (D, E) Analisis régrési modél Probit tina L-ornitin sareng fungisida komérsial Rizolex-T, masing-masing. Garis regresi modél probit dipidangkeun salaku garis biru padet, sareng interval kapercayaan (95%) dipidangkeun salaku garis beureum putus-putus.
Salian ti éta, analisis regresi probit dilaksanakeun sareng plot anu saluyu dipidangkeun dina Tabel 1 sareng Gambar 2D, E. Sacara singget, nilai lamping anu tiasa ditampi (y = 2.92x − 4.67) sareng statistik signifikan anu aya hubunganana (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 sareng p < 0.0001; Gambar 2D) tina L-ornitin nunjukkeun aktivitas antijamur anu ningkat ngalawan S. sclerotiorum dibandingkeun sareng fungisida komérsial Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 sareng p < 0.0001) (Tabel 1).
Tabel 1. Nilai konsentrasi inhibisi satengah maksimum (IC50) sareng IC99 (mg/l) L-ornitin sareng fungisida komérsial "Rizolex-T" ngalawan S. sclerotiorum.
Sacara umum, L-ornitin (250 mg/L) sacara signifikan ngirangan kamekaran sareng parahna kapang bodas dina pepelakan kacang umum anu dirawat dibandingkeun sareng pepelakan anu kainféksi S. sclerotiorum anu henteu dirawat (kontrol; Gambar 3A). Sacara singget, sanaos parahna panyakit pepelakan kontrol anu kainféksi anu henteu dirawat laun-laun ningkat (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, sareng 92,33 ± 3,06%), L-ornitin sacara signifikan ngirangan parahna panyakit (%) sapanjang ékspérimén (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, sareng 26,36 ± 3,07) masing-masing dina 7, 14, sareng 21 dinten saatos perawatan (dpt) (Gambar 3A). Sarua kitu, nalika pepelakan buncis anu kainféksi S. sclerotiorum dirawat ku 250 mg/L L-ornitin, daérah di handapeun kurva kamajuan panyakit (AUDPC) turun tina 1274,33 ± 33,13 dina kontrol anu teu dirawat janten 281,03 ± 7,95, anu rada handap tibatan kontrol positif 50 mg/L fungisida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Gambar 3B). Tren anu sami katingali dina ékspérimén kadua.
Gambar 3. Pangaruh aplikasi éksogén L-ornitin kana kamekaran busuk bodas kacang buncis anu disababkeun ku Sclerotinia sclerotiorum dina kaayaan rumah kaca. (A) Kurva kamajuan panyakit kapang bodas kacang buncis saatos dirawat ku 250 mg/L L-ornitin. (B) Area di handapeun kurva kamajuan panyakit (AUDPC) kapang bodas kacang buncis saatos dirawat ku L-ornitin. Nilai ngagambarkeun rata-rata ± SD tina lima réplika biologis (n = 5). Hurup anu béda nunjukkeun béda anu signifikan sacara statistik antara perlakuan (p < 0,05).
Aplikasi éksogén 250 mg/L L-ornitin laun-laun ningkatkeun jangkungna pepelakan (Gambar 4A), jumlah dahan per pepelakan (Gambar 4B), sareng jumlah daun per pepelakan (Gambar 4C) saatos 42 dinten. Sanaos fungisida komérsial Rizolex-T (50 mg/L) gaduh pangaruh panggedéna kana sadaya parameter nutrisi anu ditalungtik, aplikasi éksogén 250 mg/L L-ornitin gaduh pangaruh kadua panggedéna dibandingkeun sareng kontrol anu teu diubaran (Gambar 4A–C). Di sisi anu sanés, perlakuan L-ornitin teu gaduh pangaruh anu signifikan kana eusi pigmén fotosintésis klorofil a (Gambar 4D) sareng klorofil b (Gambar 4E), tapi rada ningkatkeun total eusi karotenoid (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) dibandingkeun sareng kontrol négatip (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) sareng kontrol positip (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Gambar 4F). Sacara umum, hasil ieu nunjukkeun yén L-ornitin henteu fitotoksik pikeun kacang-kacangan anu diolah sareng bahkan tiasa ngarangsang kamekaranana.
Gambar 4. Pangaruh aplikasi L-ornitin éksogén kana karakteristik kamekaran sareng pigmén fotosintésis daun buncis anu kainféksi Sclerotinia sclerotiorum dina kaayaan rumah kaca. (A) Jangkungna pepelakan (cm), (B) Jumlah dahan per pepelakan, (C) Jumlah daun per pepelakan, (D) Kandungan klorofil a (mg g-1 fr wt), (E) Kandungan klorofil b (mg g-1 fr wt), (F) Total kandungan karotenoid (mg g-1 fr wt). Nilaina nyaéta rata-rata ± SD tina lima réplika biologis (n = 5). Hurup anu béda nunjukkeun béda anu signifikan sacara statistik antara perlakuan (p < 0,05).
Lokalisasi histokimia in situ spésiés oksigén réaktif (ROS; dikedalkeun salaku hidrogén péroksida [H2O2]) sareng radikal bébas (dinyatakan salaku anion superoksida [O2•−]) ngungkabkeun yén aplikasi éksogén L-ornitin (250 mg/L) sacara signifikan ngirangan akumulasi H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Gambar 5A) sareng O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Gambar 5B) dibandingkeun sareng akumulasi pepelakan anu kainféksi anu teu diubaran (173,31 ± 12,06 sareng 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, masing-masing) sareng pepelakan anu dirawat ku 50 mg/L fungisida komérsial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 sareng 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, masing-masing) dina 72 jam. Kadar H2O2 sareng O2•− anu luhur akumulasi dina hpt (Gambar 5A, B). Sarua kitu, uji malondialdehida (MDA) berbasis TCA nunjukkeun yén pepelakan buncis anu kainféksi S. sclerotiorum ngumpulkeun kadar MDA anu langkung luhur (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) dina daunna (Gambar 5C). Nanging, aplikasi L-ornitin sacara éksogén sacara signifikan ngirangan peroksidasi lipid sakumaha anu dibuktikeun ku panurunan eusi MDA dina pepelakan anu dirawat (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Gambar 5. Pangaruh aplikasi L-ornitin éksogén kana pananda utama setrés oksidatif sareng mékanisme pertahanan antioksidan non-énzimatik dina daun buncis anu kainféksi ku S. sclerotiorum dina 72 jam pasca-inféksi dina kaayaan rumah kaca. (A) Hidrogén péroksida (H2O2; nmol g−1 FW) dina 72 hpt, (B) anion superoksida (O2•−; nmol g−1 FW) dina 72 hpt, (C) malondialdehida (MDA; nmol g−1 FW) dina 72 hpt, (D) total fenol anu leyur (mg GAE g−1 FW) dina 72 hpt, (E) total flavonoid anu leyur (mg RE g−1 FW) dina 72 hpt, (F) total asam amino bébas (mg g−1 FW) dina 72 hpt, sareng (G) eusi prolin (mg g−1 FW) dina 72 hpt. Nilai-nilai ieu ngagambarkeun rata-rata ± simpangan baku (rata-rata ± SD) tina 5 ulangan biologis (n = 5). Hurup anu béda-béda nunjukkeun béda anu signifikan sacara statistik antara perlakuan (p < 0,05).