Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman modeu kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal nampilkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Nanopartikel insulin (NP) kalayan eusi loading anu luhur parantos mendakan aplikasi anu béda-béda dina bentuk dosis anu béda-béda. Panilitian ieu ngagaduhan tujuan pikeun meunteun pangaruh prosés pengeringan beku sareng pengeringan semprot kana struktur nanopartikel kitosan anu dieusi insulin, kalayan atanapi tanpa manitol salaku krioprotektan. Kami ogé meunteun kualitas nanopartikel ieu ku cara ngaleyurkeun deui. Sateuacan dehidrasi, ukuran partikel nanopartikel kitosan/natrium tripolifosfat/insulin anu dihubungkeun silang dioptimalkeun janten 318 nm, PDI nyaéta 0,18, efisiensi enkapsulasi nyaéta 99,4%, sareng loading nyaéta 25,01%. Saatos rekonstitusi, sadaya nanopartikel, kecuali anu dihasilkeun ku metode pengeringan beku tanpa nganggo manitol, ngajaga struktur partikel buleudna. Dibandingkeun sareng nanopartikel anu ngandung manitol anu didehidrasi ku boh semprotan, nanopartikel anu dikeringkeun semprot bébas manitol ogé nunjukkeun ukuran partikel rata-rata pangleutikna (376 nm) sareng eusi loading pangluhurna. (25,02%) kalayan laju enkapsulasi anu sami (98,7%) sareng PDI (0,20) ku téknik pangeringan atanapi pangeringan beku. Nanopartikel anu dikeringkeun ku pangeringan semprot tanpa manitol ogé ngahasilkeun sékrési insulin anu panggancangna sareng efisiensi serapan sél anu pangluhurna. Karya ieu nunjukkeun yén pangeringan semprot tiasa ngadéhidrasi nanopartikel insulin tanpa peryogi krioprotektan dibandingkeun sareng metode pangeringan beku konvensional, nyiptakeun kapasitas pemuatan anu langkung ageung, sarat aditif anu langkung handap sareng biaya operasi kaunggulan anu signifikan.
Ti saprak kapanggihna dina taun 19221,2,3, insulin sareng olahan farmasina parantos nyalametkeun nyawa pasien diabetes tipe 1 (T1DM) sareng diabetes tipe 2 (T1DM). Nanging, kusabab sipatna salaku protéin beurat molekul anu luhur, insulin gampang diagregasi, dipecah ku énzim protéolitik, sareng dieliminasi ku éfék first-pass. Jalma anu didiagnosis diabetes tipe 1 peryogi suntikan insulin salami hirupna. Seueur pasien anu mimitina didiagnosis diabetes tipe 2 ogé peryogi suntikan insulin jangka panjang. Suntikan insulin sapopoé mangrupikeun sumber nyeri sareng teu ngarareunah sapopoé anu serius pikeun jalma-jalma ieu, kalayan pangaruh négatif kana kaséhatan méntal. Hasilna, bentuk administrasi insulin sanés anu nyababkeun kirang ngarareunah, sapertos administrasi insulin oral, nuju ditalungtik sacara éksténsif5 sabab gaduh poténsi pikeun mulangkeun kualitas hirup sakitar 5 milyar jalma anu ngagaduhan diabetes di sakumna dunya.
Téhnologi nanopartikel parantos nyayogikeun kamajuan anu signifikan dina usaha pikeun nyandak insulin oral4,6,7. Anu sacara efektif ngabungkus sareng ngajaga insulin tina degradasi pikeun pangiriman anu ditujukeun ka situs awak anu khusus. Nanging, panggunaan formulasi nanopartikel ngagaduhan sababaraha watesan, utamina kusabab masalah stabilitas suspénsi partikel. Sababaraha agregasi tiasa kajantenan nalika panyimpenan, anu ngirangan bioavailabilitas nanopartikel anu dieusi insulin8. Salaku tambahan, stabilitas kimia matriks polimér nanopartikel sareng insulin ogé kedah dipertimbangkeun pikeun mastikeun stabilitas nanopartikel insulin (NP). Ayeuna, téknologi pangeringan beku mangrupikeun standar emas pikeun nyiptakeun NP anu stabil bari nyegah parobahan anu teu dihoyongkeun nalika panyimpenan9.
Nanging, pangeringan beku meryogikeun panambahan krioprotektan pikeun nyegah struktur buleud NP kapangaruhan ku setrés mékanis kristal és. Ieu sacara signifikan ngirangan beban nanopartikel insulin saatos liofilisasi, sabab krioprotektan ngeusian kalolobaan babandingan beurat. Ku alatan éta, NP insulin anu dihasilkeun sering kapendak henteu cocog pikeun ngadamel formulasi bubuk garing, sapertos tablet oral sareng pilem oral, kusabab kabutuhan nanopartikel garing dina jumlah anu ageung pikeun ngahontal jandela terapi insulin.
Pangeringan semprot mangrupikeun prosés skala industri anu terkenal sareng murah pikeun ngahasilkeun bubuk garing tina fase cair dina industri farmasi10,11. Kontrol kana prosés formasi partikel ngamungkinkeun enkapsulasi anu leres tina sababaraha sanyawa bioaktif12, 13. Salajengna, éta parantos janten téknik anu efektif pikeun nyiapkeun protéin anu dienkapsulasi pikeun administrasi oral. Salila pangeringan semprot, cai nguap gancang pisan, anu ngabantosan ngajaga suhu inti partikel tetep handap11,14, ngamungkinkeun aplikasi na pikeun ngabungkus komponén anu sénsitip kana panas. Sateuacan pangeringan semprot, bahan palapis kedah dihomogenisasi sacara saksama sareng larutan anu ngandung bahan anu dienkapsulasi11,14. Teu sapertos pangeringan beku, homogenisasi sateuacan enkapsulasi dina pangeringan semprot ningkatkeun efisiensi enkapsulasi salami dehidrasi. Kusabab prosés enkapsulasi pangeringan semprot henteu meryogikeun krioprotektan, pangeringan semprot tiasa dianggo pikeun ngahasilkeun NP garing kalayan eusi pemuatan anu luhur.
Panilitian ieu ngalaporkeun produksi NP anu dieusi insulin ku cara ngaitkeun silang kitosan sareng natrium tripolifosfat nganggo metode gél ion. Gelasi ion mangrupikeun metode persiapan anu ngamungkinkeun produksi nanopartikel ngalangkungan interaksi éléktrostatik antara dua atanapi langkung spésiés ionik dina kaayaan anu tangtu. Duanana téknik pengeringan beku sareng pengeringan semprot dianggo pikeun ngadehidrasi nanopartikel anu dihubungkeun silang kitosan/natrium tripolifosfat/insulin anu dioptimalkeun. Saatos dehidrasi, morfologi na dianalisis ku SEM. Kamampuh rekombinasi na dievaluasi ku cara ngukur distribusi ukuran, muatan permukaan, PDI, efisiensi enkapsulasi, sareng eusi pemuatan. Kualitas nanopartikel anu dilarutkeun deui anu dihasilkeun ku metode dehidrasi anu béda ogé dievaluasi ku cara ngabandingkeun panyalindungan insulin, paripolah pelepasan, sareng khasiat serapan sélular na.
pH larutan campuran sareng babandingan kitosan sareng insulin mangrupikeun dua faktor konci anu mangaruhan ukuran partikel sareng efisiensi enkapsulasi (EE) tina NP akhir, sabab sacara langsung mangaruhan prosés gelasi ionotropik. pH larutan campuran dipidangkeun berkorelasi pisan sareng ukuran partikel sareng efisiensi enkapsulasi (Gambar 1a). Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 1a, nalika pH ningkat tina 4,0 ka 6,0, ukuran partikel rata-rata (nm) turun sareng EE ningkat sacara signifikan, sedengkeun nalika pH ningkat janten 6,5, ukuran partikel rata-rata mimiti ningkat sareng EE tetep teu robih. Nalika babandingan kitosan sareng insulin ningkat, ukuran partikel rata-rata ogé ningkat. Salajengna, teu aya parobahan dina EE anu dititénan nalika nanopartikel disiapkeun dina babandingan massa kitosan/insulin langkung luhur tibatan 2,5:1 (w/w) (Gambar 1b). Ku alatan éta, kaayaan persiapan optimal dina panilitian ieu (pH 6,0, babandingan massa kitosan/insulin 2,5:1) dianggo pikeun nyiapkeun nanopartikel anu dieusi insulin pikeun panilitian salajengna. Dina kaayaan persiapan ieu, ukuran partikel rata-rata nanopartikel insulin dioptimalkeun janten 318 nm (Gambar 1c), PDI nyaéta 0,18, efisiensi panyisipan nyaéta 99,4%, poténsi zeta nyaéta 9,8 mv, sareng beban insulin nyaéta 25,01% (m/m). Dumasar kana hasil mikroskop éléktron transmisi (TEM), nanopartikel anu dioptimalkeun kasarna buleud sareng diskrit kalayan ukuran anu relatif seragam (Gambar 1d).
Optimasi parameter nanopartikel insulin: (a) pangaruh pH kana diaméter rata-rata sareng efisiensi enkapsulasi (EE) nanopartikel insulin (disiapkeun dina babandingan massa 5:1 kitosan sareng insulin); (b) kitosan sareng Pangaruh babandingan massa insulin kana diaméter rata-rata sareng efisiensi enkapsulasi (EE) NP insulin (disiapkeun dina pH 6); (c) distribusi ukuran partikel nanopartikel insulin anu dioptimalkeun; (d) mikrograf TEM tina NP insulin anu dioptimalkeun.
Kitosan téh geus dipikanyaho umum yén kitosan téh poliéléktrolit lemah kalawan pKa 6,5. Dina média asam, éta boga muatan positif sabab gugus amino utama na diprotonasi ku ion hidrogén 15. Ku kituna, éta mindeng dipaké salaku pamawa pikeun ngabungkus makromolekul nu boga muatan négatif. Dina ieu panilitian, kitosan dipaké pikeun ngabungkus insulin kalawan titik isoélektrik 5,3. Kusabab kitosan dipaké salaku bahan palapis, kalawan ningkatna proporsina, ketebalan lapisan luar nanopartikel ningkat sacara saluyu, ngahasilkeun ukuran partikel rata-rata nu leuwih gedé. Salian ti éta, tingkat kitosan nu leuwih luhur bisa ngabungkus leuwih loba insulin. Dina kasus urang, EE pangluhurna nalika babandingan kitosan jeung insulin ngahontal 2,5:1, sarta teu aya parobahan nu signifikan dina EE nalika babandingan terus ningkat.
Salian ti babandingan kitosan sareng insulin, pH ogé maénkeun peran penting dina persiapan NP. Gan et al. 17 nalungtik pangaruh pH kana ukuran partikel nanopartikel kitosan. Aranjeunna mendakan panurunan ukuran partikel anu terus-terusan dugi ka pH ngahontal 6,0, sareng paningkatan anu signifikan dina ukuran partikel dititénan dina pH > 6,0, anu saluyu sareng pangamatan kami. Fenomena ieu disababkeun ku kanyataan yén kalayan ningkatna pH, molekul insulin kéngingkeun muatan permukaan négatip, ku kituna, langkung milih interaksi éléktrostatik sareng kompleks kitosan / natrium tripolifosfat (TPP), anu ngahasilkeun ukuran partikel anu alit sareng EE anu luhur. Nanging, nalika pH disaluyukeun janten 6,5, gugus amino dina kitosan dideprotonasi, anu ngahasilkeun lipatan kitosan. Ku kituna, pH anu luhur ngahasilkeun paparan ion amino anu langkung sakedik kana TPP sareng insulin, anu ngahasilkeun cross-linking anu langkung handap, ukuran partikel rata-rata akhir anu langkung ageung sareng EE anu langkung handap.
Analisis sipat morfologis NP anu garing beku sareng garing semprot tiasa nungtun pilihan téknik dehidrasi sareng formasi bubuk anu langkung saé. Métode anu dipikaresep kedah nyayogikeun stabilitas ubar, bentuk partikel anu seragam, pemuatan ubar anu luhur sareng kalarutan anu saé dina larutan aslina. Dina panilitian ieu, pikeun ngabandingkeun dua téknik ieu langkung saé, NP insulin kalayan atanapi tanpa manitol 1% dianggo nalika dehidrasi. Manitol dianggo salaku agén bulking atanapi krioprotektan dina rupa-rupa formulasi bubuk garing pikeun pangeringan beku sareng pangeringan semprot. Pikeun nanopartikel insulin anu diliofilisasi tanpa manitol, sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 2a, struktur bubuk anu porous pisan kalayan permukaan anu ageung, henteu teratur sareng kasar dititénan dina mikroskop éléktron scanning (SEM). Saeutik partikel diskrit anu dideteksi dina bubuk saatos dehidrasi (Gambar 2e). Hasil ieu nunjukkeun yén kalolobaan NP diuraikeun nalika pangeringan beku tanpa krioprotektan. Pikeun nanopartikel insulin anu garing beku sareng garing semprot anu ngandung 1% manitol, nanopartikel buleud kalayan permukaan anu lemes dititénan (Gambar 1). 2b,d,f,h). Nanopartikel insulin anu dikeringkeun ku semprot tanpa manitol tetep buleud tapi keriput dina beungeutna (Gambar 2c). Beungeut buleud sareng keriput dibahas salajengna dina paripolah pelepasan sareng uji serapan sélular di handap. Dumasar kana penampilan anu katingali tina NP anu dikeringkeun, duanana NP anu dikeringkeun ku semprot tanpa manitol sareng NP anu dikeringkeun ku beku sareng dikeringkeun ku semprot nganggo manitol ngahasilkeun bubuk NP anu lemes (Gambar 2f,g,h). Beuki ageung luas permukaan antara beungeut partikel, beuki luhur kalarutanana sareng ku kituna beuki luhur laju pelepasanana.
Morfologi NP insulin dehidrasi anu béda-béda: (a) Gambar SEM tina NP insulin liofilisasi tanpa manitol; (b) Gambar SEM tina NP insulin liofilisasi nganggo manitol; (c) NP insulin semprot-garing tanpa manitol Gambar SEM tina ; (d) Gambar SEM tina NP insulin semprot-garing nganggo manitol; (e) gambar bubuk NP insulin liofilisasi tanpa manitol; (f) gambar NP insulin liofilisasi nganggo manitol; (g) Gambar bubuk NP insulin semprot-garing tanpa manitol; (h) gambar bubuk NP insulin semprot-garing nganggo manitol.
Salila pangeringan beku, manitol bertindak salaku krioprotektan, ngajaga NP dina bentuk amorf sareng nyegah karusakan ku kristal és19. Sabalikna, teu aya léngkah beku nalika pangeringan semprot. Ku kituna manitol henteu diperyogikeun dina metode ieu. Nyatana, NP anu disemprot tanpa manitol ngahasilkeun NP anu langkung lemes sapertos anu dijelaskeun sateuacanna. Nanging, manitol masih tiasa bertindak salaku pangisi dina prosés pangeringan semprot pikeun masihan NP struktur anu langkung buleud20 (Gambar 2d), anu ngabantosan pikeun kéngingkeun paripolah pelepasan anu seragam tina NP anu dienkapsulasi sapertos kitu. Salaku tambahan, jelas yén sababaraha partikel ageung tiasa dideteksi dina NP insulin anu dibekukeun sareng anu disemprot anu ngandung manitol (Gambar 2b, d), anu tiasa disababkeun ku akumulasi manitol dina inti partikel babarengan sareng insulin anu dienkapsulasi. Ka. Lapisan kitosan. Perlu dicatet yén dina panilitian ieu, pikeun mastikeun yén struktur buleud tetep utuh saatos dehidrasi, babandingan manitol sareng kitosan dijaga dina 5:1, supados sajumlah ageung pangisi ogé tiasa ngagedekeun ukuran partikel NP anu garing.
Spéktroskopi Fourier transform infra red attenuated total reflection (FTIR-ATR) ngacirikeun campuran fisik insulin bébas, kitosan, kitosan, TPP sareng insulin. Sadaya NP dehidrasi dicirikeun ku ngagunakeun spéktroskopi FTIR-ATR. Anu penting, intensitas pita 1641, 1543 sareng 1412 cm-1 dititénan dina NP anu dienkapsulasi anu dibekukeun-garingkeun nganggo manitol sareng dina NP anu disemprot-garingkeun nganggo sareng tanpa manitol (Gambar 3). Sakumaha anu dilaporkeun sateuacanna, paningkatan kakuatan ieu aya hubunganana sareng cross-linking antara kitosan, TPP sareng insulin. Panalungtikan ngeunaan interaksi antara kitosan sareng insulin nunjukkeun yén dina spéktra FTIR nanopartikel kitosan anu dieusi insulin, pita kitosan tumpang tindih sareng insulin, ningkatkeun inténsitas karbonil (1641 cm-1) sareng sabuk amina (1543 cm-1). Gugus tripolifosfat TPP dihubungkeun sareng gugus amonium dina kitosan, ngabentuk pita. dina 1412 cm-1.
Spéktra FTIR-ATR tina insulin bébas, kitosan, campuran fisik kitosan/TPP/insulin sareng NP anu didehidrasi ku sababaraha metode.
Salajengna, hasil ieu saluyu sareng anu dipidangkeun dina SEM, anu nunjukkeun yén NP anu dienkapsulasi tetep utuh nalika disemprot sareng dikeringkeun beku nganggo manitol, tapi upami teu aya manitol, ngan ukur pengeringan semprot anu ngahasilkeun partikel anu dienkapsulasi. Sabalikna, hasil spéktral FTIR-ATR tina NP anu dikeringkeun beku tanpa manitol sami pisan sareng campuran fisik kitosan, TPP, sareng insulin. Hasil ieu nunjukkeun yén hubungan silang antara kitosan, TPP sareng insulin henteu aya deui dina NP anu dikeringkeun beku tanpa manitol. Struktur NP ancur nalika pengeringan beku tanpa krioprotektan, anu tiasa ditingali dina hasil SEM (Gambar 2a). Dumasar kana morfologi sareng hasil FTIR tina NP insulin dehidrasi, ngan ukur NP liofilisasi, dikeringkeun semprot, sareng bébas manitol anu dianggo pikeun ékspérimén rékonstitusi sareng NP bébas manitol kusabab dékomposisi NP bébas manitol nalika dehidrasi. bahas.
Dehidrasi dianggo pikeun panyimpenan jangka panjang sareng diolah deui kana formulasi anu sanés. Kamampuh NP garing pikeun dibentuk deui saatos disimpen penting pisan pikeun panggunaanana dina formulasi anu béda sapertos tablet sareng pilem. Kami perhatoskeun yén ukuran partikel rata-rata NP insulin anu disemprot garing tanpa manitol ngan ukur ningkat sakedik saatos dibentuk deui. Di sisi anu sanés, ukuran partikel nanopartikel insulin anu disemprot garing sareng dibekukeun garing sareng manitol ningkat sacara signifikan (Tabel 1). PDI sareng EE henteu robih sacara signifikan (p > 0,05) saatos rekombinasi sadaya NP dina panilitian ieu (Tabel 1). Hasil ieu nunjukkeun yén kaseueuran partikel tetep utuh saatos dilarutkeun deui. Nanging, panambahan manitol nyababkeun panurunan anu ageung dina beban insulin tina nanopartikel manitol anu diliofilisasi sareng disemprot garing (Tabel 1). Sabalikna, eusi beban insulin NP anu disemprot garing tanpa manitol tetep sami sareng sateuacanna (Tabel 1).
Geus dipikanyaho yén pemuatan nanopartikel penting pisan nalika dianggo pikeun tujuan pangiriman ubar. Pikeun NP kalayan pemuatan anu handap, jumlah bahan anu ageung pisan diperyogikeun pikeun ngahontal ambang terapi. Nanging, viskositas anu luhur tina konsentrasi NP anu luhur sapertos kitu nyababkeun gangguan sareng kasusah dina administrasi oral sareng formulasi suntik, masing-masing 22. Salaku tambahan, NP insulin ogé tiasa dianggo pikeun ngadamel tablet sareng biofilm kentel 23, 24, anu meryogikeun panggunaan jumlah NP anu ageung dina tingkat pemuatan anu handap, anu ngahasilkeun tablet ageung sareng biofilm kandel anu henteu cocog pikeun aplikasi oral. Ku alatan éta, NP dehidrasi kalayan beban insulin anu luhur dipikahoyong pisan. Hasil kami nunjukkeun yén beban insulin anu luhur tina NP semprot-garing bébas manitol tiasa nawiskeun seueur kaunggulan anu pikaresepeun pikeun metode pangiriman alternatif ieu.
Sadaya NP anu didehidrasi disimpen dina kulkas salami tilu bulan. Hasil SEM nunjukkeun yén morfologi sadaya NP anu didehidrasi henteu robih sacara signifikan salami panyimpenan tilu bulan (Gambar 4). Saatos dibentuk deui dina cai, sadaya NP nunjukkeun panurunan EE anu sakedik sareng ngaleupaskeun sakitar sajumlah alit (~5%) insulin salami periode panyimpenan tilu bulan (Tabel 2). Nanging, ukuran partikel rata-rata sadaya nanopartikel ningkat. Ukuran partikel NP anu disemprot-garing tanpa manitol ningkat janten 525 nm, sedengkeun NP anu disemprot-garing sareng dibeku-garing nganggo manitol ningkat janten 872 sareng 921 nm, masing-masing (Tabel 2).
Morfologi rupa-rupa NP insulin dehidrasi anu disimpen salami tilu bulan: (a) Gambar SEM tina NP insulin liofilisasi nganggo manitol; (b) Gambar SEM tina nanopartikel insulin semprot-garing tanpa manitol; (c) tanpa manitol Gambar SEM tina NP insulin semprot-garing.
Salajengna, endapan katingali dina nanopartikel insulin anu dilarutkeun deui anu dikeringkeun ku manitol sareng dikeringkeun beku (Gambar S2). Ieu tiasa disababkeun ku partikel ageung anu henteu ngagantung kalayan leres dina cai. Sadaya hasil di luhur nunjukkeun yén téknik pengeringan semprot tiasa ngajaga nanopartikel insulin tina dehidrasi sareng yén nanopartikel insulin anu seueur tiasa didapet tanpa aya pangisi atanapi krioprotektan.
Retensi insulin diuji dina média pH = 2,5 nganggo pepsin, tripsin, sareng α-kimotripsin pikeun nunjukkeun kamampuan pelindung NP ngalawan pencernaan énzimatik saatos dehidrasi. Retensi insulin NP anu dehidrasi dibandingkeun sareng NP anu nembé disiapkeun, sareng insulin bébas dianggo salaku kontrol négatip. Dina panilitian ieu, insulin bébas nunjukkeun éliminasi insulin anu gancang dina 4 jam dina sadaya tilu perlakuan énzimatik (Gambar 5a–c). Sabalikna, uji éliminasi insulin NP anu dibekukeun-garing nganggo manitol sareng NP anu disemprot-garing nganggo atanapi tanpa manitol nunjukkeun panyalindungan NP ieu anu langkung luhur sacara signifikan ngalawan pencernaan énzimatik, anu sami sareng NP insulin anu nembé disiapkeun (gambar 1).5a-c). Kalayan bantosan nanopartikel dina pepsin, tripsin, sareng α-kimotripsin, langkung ti 50%, 60%, sareng 75% insulin tiasa dijaga dina 4 jam, masing-masing (Gambar 5a–c). Kamampuan pelindung insulin ieu tiasa ningkatkeun kasempetan panyerepan insulin anu langkung luhur kana aliran getih25. Hasil ieu nunjukkeun yén pangeringan semprot nganggo atanapi tanpa manitol sareng pangeringan beku nganggo manitol tiasa ngajaga kamampuan NP-protektif insulin saatos dehidrasi.
Paripolah panyalindungan sareng pelepasan NP insulin dehidrasi: (a) panyalindungan insulin dina larutan pepsin; (b) panyalindungan insulin dina larutan tripsin; (c) panyalindungan insulin ku larutan α-kimotripsin; (d) Paripolah pelepasan NP dehidrasi dina larutan pH = 2,5; (e) paripolah pelepasan NP dehidrasi dina larutan pH = 6,6; (f) paripolah pelepasan NP dehidrasi dina larutan pH = 7,0.
NP insulin garing anu nembé disiapkeun sareng dilarutkeun deui diinkubasi dina rupa-rupa buffer (pH = 2,5, 6,6, 7,0) dina suhu 37 °C, ngasimulasikeun lingkungan pH lambung, duodenum, sareng peujit leutik bagian luhur, pikeun nalungtik pangaruh insulin kana résistansi insulin. Paripolah pelepasan dina lingkungan anu béda. Fragmen saluran cerna. Dina pH = 2,5, NP anu dieusi insulin sareng NP insulin garing anu dilarutkeun deui nunjukkeun pelepasan burst awal dina hiji jam kahiji, dituturkeun ku pelepasan laun salami 5 jam ka hareup (Gambar 5d). Pelepasan gancang ieu dina awalna kamungkinan mangrupikeun hasil tina desorpsi permukaan molekul protéin anu gancang anu henteu sapinuhna teu tiasa digerakkeun dina struktur internal partikel. Dina pH = 6,5, NP anu dieusi insulin sareng NP insulin garing anu dibentuk deui nunjukkeun pelepasan anu lancar sareng laun salami 6 jam, sabab pH larutan uji sami sareng larutan anu disiapkeun NP (Gambar 5e). Dina pH = 7, NP henteu stabil sareng ampir lengkep terurai dina dua jam kahiji (Gambar 5f). Ieu kusabab deprotonasi kitosan lumangsung dina pH anu langkung luhur, anu ngahasilkeun jaringan polimér anu kirang kompak sareng pelepasan insulin anu dieusi.
Salajengna, NP insulin anu disemprot-garingkeun tanpa manitol nunjukkeun profil pelepasan anu langkung gancang tibatan NP dehidrasi anu sanés (Gambar 5d–f). Sakumaha anu parantos dijelaskeun sateuacanna, NP insulin anu dibentuk deui anu dikeringkeun tanpa manitol nunjukkeun ukuran partikel pangleutikna. Partikel alit nyayogikeun luas permukaan anu langkung ageung, janten kaseueuran ubar anu relevan bakal aya dina atanapi caket permukaan partikel, anu ngahasilkeun pelepasan ubar anu gancang26.
Sitotoksisitas NP ditalungtik ku uji MTT. Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar S4, sadaya NP anu didehidrasi henteu gaduh pangaruh anu signifikan kana viabilitas sél dina konsentrasi 50–500 μg/ml, nunjukkeun yén sadaya NP anu didehidrasi tiasa dianggo kalayan aman pikeun ngahontal jandela terapi.
Ati nyaéta organ utama anu dianggo ku insulin pikeun ngalaksanakeun fungsi fisiologisna. Sél HepG2 nyaéta garis sél hepatoma manusa anu umumna dianggo salaku modél serapan hepatosit in vitro. Di dieu, sél HepG2 dianggo pikeun meunteun serapan sélular NP anu didehidrasi nganggo metode pengeringan beku sareng pengeringan semprot. Serapan sélular ku scanning laser confocal nganggo sitometri aliran sareng visi saatos sababaraha jam inkubasi nganggo insulin FITC bébas dina konsentrasi 25 μg/mL, NP anu dieusi insulin FITC anu nembé disiapkeun sareng NP anu dieusi insulin FITC anu didehidrasi dina konsentrasi insulin anu sami. Observasi mikroskop kuantitatif (CLSM) dilakukeun. NP anu diliofilisasi tanpa manitol ancur nalika dehidrasi sareng henteu dievaluasi dina tés ieu. Intensitas fluoresensi intraseluler NP anu dieusi insulin anu nembé disiapkeun, NP anu diliofilisasi nganggo manitol, sareng NP anu disemprotan garing nganggo sareng tanpa manitol (Gambar 6a) nyaéta 4,3, 2,6, 2,4, sareng 4,1 kali langkung luhur tibatan anu bébas. Gugus FITC-insulin, masing-masing (Gambar 6b). Hasil ieu nunjukkeun yén insulin anu dienkapsulasi langkung kuat dina serapan sélular tibatan insulin bébas, utamina kusabab ukuran nanopartikel anu dieusi insulin anu langkung alit anu dihasilkeun dina panilitian ieu.
Serapan sél HepG2 saatos inkubasi 4 jam sareng NP anu nembé disiapkeun sareng NP anu didehidrasi: (a) Distribusi serapan insulin FITC ku sél HepG2. (b) Rata-rata géométri tina inténsitas fluoresensi anu dianalisis ku sitometri aliran (n = 3), *P < 0,05 dibandingkeun sareng insulin bébas.
Kitu ogé, gambar CLSM nunjukkeun yén inténsitas fluoresensi FITC tina NP anu nembé disiapkeun anu dieusi insulin FITC sareng NP anu disemprot-garing anu dieusi insulin FITC (tanpa manitol) langkung kuat tibatan sampel anu sanés (Gambar 6a). Salajengna, kalayan tambahan manitol, viskositas larutan anu langkung luhur ningkatkeun résistansi kana serapan sélular, anu nyababkeun panurunan proliferasi insulin. Hasil ieu nunjukkeun yén NP anu disemprot-garing bébas manitol nunjukkeun efisiensi serapan sélular pangluhurna sabab ukuran partikelna langkung alit tibatan NP anu dibekukeun-garing saatos dilarutkeun deui.
Kitosan (beurat molekul rata-rata 100 KDa, 75–85% dideasetilasi) dipésér ti Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Natrium tripolifosfat (TPP) dipésér ti VWR (Radnor, Pennsylvania, AS). Insulin manusa rekombinan anu dianggo dina panilitian ieu nyaéta ti Fisher Scientific (Waltham, MA, AS). Insulin manusa anu dilabélan Fluorescein isothiocyanate (FITC) sareng 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihidroklorida (DAPI) dipésér ti Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Garis sél HepG2 didapet ti ATCC (Manassas, Virginia, AS). Sadaya réagen anu sanés mangrupikeun kelas analitis atanapi kromatografi.
Nyiapkeun larutan CS 1 mg/ml ku cara ngaleyurkeunana dina cai sulingan ganda (cai DD) anu ngandung 0,1% asam asetat. Nyiapkeun larutan 1 mg/ml TPP sareng insulin ku cara ngaleyurkeunana dina cai DD sareng asam asetat 0,1%. Pra-émulsi disiapkeun nganggo homogenizer kecepatan tinggi polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Prosés persiapanna sapertos kieu: mimitina, 2 ml larutan TPP ditambahkeun kana 4 ml larutan insulin, teras campuran diaduk salami 30 menit sareng dicampur sapinuhna. Teras, larutan campuran ditambahkeun tetes demi tetes kana larutan CS ngalangkungan jarum suntik kalayan diaduk kecepatan tinggi (10.000 rpm). Campuran dijaga dina diaduk kecepatan tinggi (15.000 rpm) dina bak és salami 30 menit, sareng disaluyukeun kana pH anu tangtu pikeun kéngingkeun NP insulin anu dihijikeun silang. Pikeun langkung ngahomogenisasi sareng ngirangan ukuran partikel NP insulin, aranjeunna disonikasi salami 30 menit tambahan dina bak és nganggo sonikator tipe probe (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Jerman).
NPS insulin diuji pikeun diaméter rata-rata Z, indéks polidispersitas (PDI) sareng poténsi zeta nganggo pangukuran hamburan cahaya dinamis (DLS) nganggo Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) ku cara ngencerkeunana dina cai DD dina suhu 25°C. Morfologi sareng distribusi ukuran dicirikeun ku mikroskop éléktron transmisi Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Tokyo, Jepang), sareng gambar salajengna dianalisis nganggo parangkat lunak pencitraan Hitachi (Hitachi, Tokyo, Jepang). Pikeun meunteun efisiensi enkapsulasi (EE) sareng kapasitas pemuatan (LC) NP insulin, NP dipipet kana tabung ultrafiltrasi kalayan cut-off beurat molekul 100 kDa sareng disentrifugasi dina 500 xg salami 30 menit. Insulin anu teu dienkapsulasi dina filtrat diukur nganggo sistem HPLC Seri Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, California, AS) anu diwangun ku pompa kuaterner, autosampler, kolom. pemanas, sareng detektor DAD. Insulin dianalisis ku kolom C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) sareng dideteksi dina 214 nm. Fase gerakna nyaéta asetonitril sareng cai, ngandung 0,1% TFA, babandingan gradien ti 10/90 dugi ka 100/0, sareng dijalankeun salami 10 menit. Fase gerak dipompa dina laju aliran 1,0 ml/mnt. Suhu kolom disetel ka 20 °C. Hitung persentase EE sareng LC nganggo persamaan. (1) sareng Persamaan. (2).
Rupa-rupa babandingan CS/insulin mimitian ti 2.0 nepi ka 4.0 diuji pikeun ngaoptimalkeun NP insulin. Jumlah larutan CS anu béda-béda ditambahkeun nalika persiapan, sedengkeun campuran insulin/TPP dijaga konstan. NP Insulin disiapkeun dina kisaran pH 4.0 nepi ka 6.5 ku cara ngontrol pH campuran sacara saksama saatos nambihan sadaya larutan (insulin, TPP sareng CS). EE sareng ukuran partikel nanopartikel insulin dievaluasi dina nilai pH anu béda sareng babandingan massa CS/insulin pikeun ngaoptimalkeun formasi NP insulin.
NP insulin anu dioptimalkeun disimpen dina wadah aluminium teras ditutup ku jaringan anu diketatkeun ku sababaraha pita. Salajengna, wadah anu disekrup disimpen dina pengering beku Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) anu dilengkepan ku pengering baki. Suhu sareng tekanan vakum disetel dina -10 °C, 0,350 Torr salami 2 jam mimiti, sareng 0 °C sareng 0,120 Torr salami 22 jam sésana tina 24 jam pikeun kéngingkeun NP insulin garing.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Swiss) dianggo pikeun ngahasilkeun insulin anu dienkapsulasi. Parameter pangeringan anu dipilih nyaéta: suhu 100 °C, aliran eupan 3 L/mnt, sareng aliran gas 4 L/mnt.
NP insulin sateuacan sareng saatos dehidrasi dicirikeun nganggo spéktroskopi FTIR-ATR. Nanopartikel anu didehidrasi ogé insulin bébas sareng kitosan dianalisis nganggo spektrofotometer Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, AS) anu dilengkepan ku aksésoris sampling ATR universal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, AS). Rata-rata sinyal diala tina 16 scan dina résolusi 4 cm2 dina rentang frékuénsi 4000-600 cm2.
Morfologi NP insulin garing dipeunteun ku gambar SEM tina NP insulin anu dibekukeun sareng disemprot anu dicandak ku Mikroskop Éléktron Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, AS). Parameter utama anu dianggo nyaéta tegangan 5 keV sareng arus 30 mA.
Sadaya NP insulin anu didehidrasi dilarutkeun deui dina cai dd. Ukuran partikel, PDI, EE sareng LC diuji deui nganggo metode anu sami anu disebatkeun sateuacanna pikeun meunteun kualitasna saatos dehidrasi. Stabilitas NP anhidroinsulin ogé diukur ku cara nguji sipat NP saatos disimpen lami. Dina panilitian ieu, sadaya NP saatos dehidrasi disimpen dina kulkas salami tilu bulan. Saatos tilu bulan disimpen, NP diuji pikeun ukuran partikel morfologis, PDI, EE sareng LC.
Larutkeun 5 mL NP anu parantos dibentuk deui kana 45 mL anu ngandung cairan lambung simulasi (pH 1.2, ngandung 1% pepsin), cairan peujit (pH 6.8, ngandung 1% tripsin) atanapi larutan kimotripsin (100 g/mL, dina buffer fosfat, pH 7.8) pikeun meunteun éféktivitas insulin dina ngajaga NP saatos dehidrasi. Éta diinkubasi dina suhu 37°C kalayan kecepatan agitasi 100 rpm. 500 μL larutan dikumpulkeun dina titik waktos anu béda sareng konsentrasi insulin ditangtukeun ku HPLC.
Paripolah pelepasan in vitro tina NP insulin anu nembé disiapkeun sareng didehidrasi diuji ku metode kantong dialisis (potongan beurat molekul 100 kDa, Spectra Por Inc.). NP garing anu nembé disiapkeun sareng dibentuk deui dialisis dina cairan dina pH 2,5, pH 6,6, sareng pH 7,0 (0,1 M phosphate-buffered saline, PBS) pikeun ngasimulasikeun lingkungan pH lambung, duodenum, sareng peujit leutik bagian luhur. Sadaya sampel diinkubasi dina suhu 37 °C kalayan ngocok terus-terusan dina 200 rpm. Aspirasi cairan di luar kantong dialisis 5 mL dina waktos ieu: 0,5, 1, 2, 3, 4, sareng 6 jam, sareng langsung eusian deui volume ku dialisat seger. Kontaminasi insulin dina cairan dianalisis ku HPLC, sareng laju pelepasan insulin tina nanopartikel diitung tina babandingan insulin bébas anu dileupaskeun kana total insulin anu dienkapsulasi dina nanopartikel (Persamaan 3).
Sél HepG2 garis sél karsinoma hepatoselular manusa dipelak dina piring diaméter 60 mm nganggo Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) anu ngandung 10% sérum sapi fétal, 100 IU/mL penisilin, sareng 100 μg/mL streptomisin29. Kultur dijaga dina suhu 37°C, kalembaban relatif 95%, sareng 5% CO2. Pikeun uji serapan, sél HepG2 diumbi dina 1 × 105 sél/ml kana sistem slide kamar Nunc Lab-Tek 8-sumur (Thermo Fisher, NY, AS). Pikeun uji sitotoksisitas, éta diumbi kana piring 96-sumur (Corning, NY, AS) dina kapadetan 5 × 104 sél/ml.
Uji MTT dianggo pikeun meunteun sitotoksisitas insulin NPs30 anu nembé disiapkeun sareng didehidrasi. Sél HepG2 disilangkan dina pelat 96-sumur dina kapadetan 5 × 104 sél/mL sareng dikultur salami 7 dinten sateuacan diuji. NP Insulin diéncérkeun kana rupa-rupa konsentrasi (50 dugi ka 500 μg/mL) dina média kultur teras dikaluarkeun kana sél. Saatos 24 jam inkubasi, sél dikumbah 3 kali nganggo PBS sareng diinkubasi ku média anu ngandung 0,5 mg/ml MTT salami 4 jam tambahan. Sitotoksisitas ditaksir ku cara ngukur réduksi énzimatik tina MTT tetrazolium konéng janten formazan wungu dina 570 nm nganggo pamaca pelat spektrofotometer pro Tecan infinite M200 (Tecan, Männedorf, Swiss).
Efisiensi serapan sélular NP diuji ku mikroskop scanning laser confocal sareng analisis flow cytometry. Unggal sumur sistem slide chamber Nunc Lab-Tek dirawat ku FITC-insulin bébas, NP anu dieusi insulin FITC, sareng ngawangun deui 25 μg/mL NP FITC-insulin dehidrasi dina konsentrasi anu sami sareng diinkubasi salami 4 jam. Sél dikumbah 3 kali ku PBS sareng difiksasi ku 4% paraformaldehida. Inti diwarnaan ku 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Lokalisasi insulin dititénan nganggo mikroskop confocal scanning laser/dua-foton Olympus FV1000 (Olympus, Kota Shinjuku, Tokyo, Jepang). Pikeun analisis flow cytometry, konsentrasi anu sami tina 10 μg/mL NP FITC-insulin bébas, FITC-insulin, sareng NP FITC-insulin dehidrasi anu dilarutkeun deui ditambahkeun kana pelat 96-sumur anu diunggulan ku sél HepG2 sareng diinkubasi salami 4 jam. Saatos 4 jam inkubasi, sél-sél dipiceun sareng dikumbah 3 kali nganggo FBS. 5 × 104 sél per sampel dianalisis ku BD LSR II flow cytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Amérika Serikat).
Sadaya nilai dinyatakeun salaku rata-rata ± simpangan baku. Babandingan antara sadaya kelompok dipeunteun nganggo ANOVA hiji arah atanapi uji-t ku IBM SPSS Statistics 26 pikeun Mac (IBM, Endicott, New York, AS) sareng p <0,05 dianggap signifikan sacara statistik.
Panilitian ieu nunjukkeun kalenturan sareng kamampuan pangeringan semprot pikeun ngadehidrasi nanopartikel kitosan/TPP/insulin anu dihubungkeun silang kalayan rekonstitusi anu langkung saé dibandingkeun sareng metode pangeringan beku standar anu nganggo kapasitas agén bulking atanapi krioprotektan sareng kapasitas beban anu langkung luhur. Nanopartikel insulin anu dioptimalkeun ngahasilkeun ukuran partikel rata-rata 318 nm sareng efisiensi enkapsulasi 99,4%. Hasil SEM sareng FTIR saatos dehidrasi nunjukkeun yén struktur buleud dijaga ngan ukur dina NP anu digaringkeun semprot kalayan sareng tanpa manitol sareng diliofilisasi ku manitol, tapi NP anu diliofilisasi tanpa manitol diuraikeun nalika dehidrasi. Dina tés kamampuan rekonstitusi, nanopartikel insulin anu digaringkeun semprot tanpa manitol nunjukkeun ukuran partikel rata-rata pangleutikna sareng beban pangluhurna nalika rekonstitusi. Paripolah pelepasan sadaya NP dehidrasi ieu nunjukkeun yén aranjeunna gancang dileupaskeun dina larutan pH = 2,5 sareng pH = 7, sareng stabil pisan dina larutan pH = 6,5. Dibandingkeun sareng NP dehidrasi anu dilarutkeun deui, NP Disemprot garing tanpa manitol nunjukkeun pelepasan panggancangna. Hasil ieu saluyu sareng anu dititénan dina uji serapan sélular, sabab NP anu disemprot garing tanpa manitol ampir sapinuhna ngajaga efisiensi serapan sélular NP anu nembé disiapkeun. Hasil ieu nunjukkeun yén nanopartikel insulin garing anu disiapkeun ku pengeringan semprot bébas manitol paling cocog pikeun diprosés salajengna kana bentuk dosis anhidrat anu sanés, sapertos tablet oral atanapi pilem bioadhesif.
Kusabab masalah hak cipta intelektual, sét data anu dihasilkeun sareng/atanapi dianalisis salami panilitian ayeuna henteu sayogi pikeun umum, tapi sayogi ti masing-masing panulis upami aya pamundut anu wajar.
Kagan, A. Diabetes tipe 2: asal-usul sosial sareng ilmiah, komplikasi médis, sareng implikasina pikeun pasien sareng anu sanésna. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Kamekaran enkapsulasi insulin: naha administrasi oral ayeuna mungkin? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Kamajuan anyar dina sistem pangiriman liposom oral anu dieusi insulin pikeun pengobatan diabetes. Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).