Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Vérsi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun hasil anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo vérsi browser anu langkung énggal (atanapi nonaktipkeun Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami nunjukkeun situs ieu tanpa gaya atanapi JavaScript.
Asam propionat (PPA) dianggo pikeun nalungtik peran disfungsi mitokondria dina gangguan neurodevelopmental sapertos gangguan spéktrum autisme. PPA dipikanyaho ngaganggu biogenesis, métabolisme, sareng pergantian mitokondria. Nanging, pangaruh PPA kana dinamika mitokondria, fisi sareng fusi tetep janten masalah kusabab sifat temporal anu rumit tina mékanisme ieu. Di dieu, urang nganggo téknik pencitraan kuantitatif komplementer pikeun nalungtik kumaha PPA mangaruhan ultrastruktur, morfologi, sareng dinamika mitokondria dina sél SH-SY5Y anu sapertos neuron. PPA (5 mM) nyababkeun panurunan anu signifikan dina daérah mitokondria (p < 0,01), diaméter sareng keliling Feret (p < 0,05), sareng daérah 2 (p < 0,01). Analisis locator kajadian mitokondria nunjukkeun paningkatan anu signifikan (p < 0,05) dina kajadian fisi sareng fusi, ku kituna ngajaga integritas jaringan mitokondria dina kaayaan setrés. Salian ti éta, éksprési mRNA tina cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) sareng OPA1 (p < 0,05) turun sacara signifikan. 01). Ieu ngagambarkeun remodeling morfologi mitokondria, biogenesis sareng dinamika pikeun ngajaga fungsi dina kaayaan setrés. Data kami nyayogikeun wawasan énggal ngeunaan pangaruh PPA kana dinamika mitokondria sareng nyorot mangpaat téknik pencitraan pikeun nalungtik mékanisme pangaturan anu rumit anu kalibet dina réspon setrés mitokondria.
Mitokondria mangrupikeun pamilon integral dina rupa-rupa fungsi sél saluareun peran hasna dina produksi énergi sareng biosintésis. Métabolisme mitokondria mangrupikeun régulator konci sinyal kalsium, homeostasis métabolik sareng rédoks, sinyal radang, modifikasi épigenetik, proliferasi sél, diferensiasi sareng maot sél anu diprogram1. Khususna, métabolisme mitokondria penting pisan pikeun kamekaran neuronal, salamet sareng fungsi sareng seueur kalibet dina rupa-rupa manifestasi neuropatologi2,3,4.
Salila dasawarsa ka tukang, status métabolik parantos muncul salaku pangatur sentral neurogenesis, diferensiasi, maturasi sareng plastisitas5,6. Anyar-anyar ieu, morfologi sareng dinamika mitokondria parantos janten komponén mitosis anu penting pisan, prosés dinamis anu ngajaga kumpulan mitokondria anu séhat dina sél. Dinamika mitokondria diatur ku jalur silih gumantung anu kompléks mimitian ti biogenesis mitokondria sareng bioenergetika dugi ka fisi mitokondria, fusi, transportasi sareng clearance7,8. Gangguan salah sahiji mékanisme integratif ieu ngaganggu pangropéa jaringan mitokondria anu séhat sareng gaduh akibat fungsional anu ageung pikeun neurodevelopment9,10. Memang, disregulasi dinamika mitokondria dititénan dina seueur gangguan psikiatri, neurodegeneratif sareng neurodevelopmental, kalebet gangguan spéktrum autisme (ASD)11,12.
ASD nyaéta gangguan neurodevelopmental hétérogén kalayan arsitéktur genetik sareng épigenetik anu rumit. Heritabilitas ASD teu tiasa dibantah, tapi étiologi molekuler anu mendasari masih kurang kahartos. Ngumpulkeun data tina modél praklinis, studi klinis, sareng sét data molekuler multi-omics nyayogikeun bukti disfungsi mitokondria anu ningkat dina ASD13,14. Kami sateuacanna ngalaksanakeun layar metilasi DNA sakumna génom dina kohort pasien ASD sareng ngaidentipikasi gén anu dimetilasi sacara béda anu ngagolér sapanjang jalur métabolik mitokondria15. Kami salajengna ngalaporkeun metilasi diferensial tina régulator sentral biogenesis sareng dinamika mitokondria, anu aya hubunganana sareng paningkatan jumlah salinan mtDNA sareng parobahan profil métabolik urin dina ASD16. Data kami nyayogikeun bukti anu ningkat yén dinamika mitokondria sareng homeostasis maénkeun peran sentral dina patofisiologi ASD. Ku alatan éta, ningkatkeun pamahaman mékanistik ngeunaan hubungan antara dinamika mitokondria, morfologi, sareng fungsi mangrupikeun tujuan konci tina panalungtikan anu lumangsung ngeunaan panyakit neurologis anu dicirikeun ku disfungsi mitokondria sekundér.
Téhnik molekuler sering dianggo pikeun nalungtik peran gén spésifik dina réspon setrés mitokondria. Nanging, pendekatan ieu tiasa diwatesan ku sifat multifaset sareng temporal tina mékanisme kontrol mitosis. Leuwih ti éta, éksprési diferensial gén mitokondria mangrupikeun indikator teu langsung tina parobahan fungsional, khususna kumargi ngan ukur sajumlah gén anu biasana dianalisis. Ku alatan éta, metode anu langkung langsung pikeun nalungtik fungsi mitokondria sareng bioenergetika parantos diusulkeun17. Morfologi mitokondria raket patalina sareng dinamika mitokondria. Bentuk, konéktivitas, sareng struktur mitokondria penting pisan pikeun produksi énergi sareng salametna mitokondria sareng sél5,18. Leuwih ti éta, rupa-rupa komponén mitosis museur kana parobahan dina morfologi mitokondria, anu tiasa janten titik tungtung anu mangpaat tina disfungsi mitokondria sareng nyayogikeun dasar pikeun studi mékanistik salajengna.
Morfologi mitokondria tiasa dititénan langsung nganggo mikroskop éléktron transmisi (TEM), anu ngamungkinkeun panilitian anu lengkep ngeunaan ultrastruktur sél. TEM sacara langsung ngabayangkeun morfologi, bentuk sareng struktur krista mitokondria dina résolusi mitokondria individu, tinimbang ngan ukur ngandelkeun transkripsi gén, éksprési protéin atanapi parameter fungsional mitokondria dina populasi sél17,19,20. Salaku tambahan, TEM ngagampangkeun panilitian interaksi antara mitokondria sareng organél sanés, sapertos retikulum endoplasma sareng autofagosom, anu maénkeun peran konci dina fungsi mitokondria sareng homeostasis21,22. Ku kituna, ieu ngajantenkeun TEM titik awal anu saé pikeun nalungtik disfungsi mitokondria sateuacan fokus kana jalur atanapi gén khusus. Kusabab fungsi mitokondria janten beuki relevan pikeun neuropatologi, aya kabutuhan anu jelas pikeun tiasa langsung sareng kuantitatif nalungtik morfologi sareng dinamika mitokondria dina modél neuronal in vitro.
Dina tulisan ieu, urang nalungtik dinamika mitokondria dina modél neuronal disfungsi mitokondria dina gangguan spéktrum autisme. Kami sateuacanna ngalaporkeun metilasi diferensial propionil-CoA karboksilase beta (PCCB) dina ASD15, subunit énzim propionil-CoA karboksilase mitokondria PCC. Disregulasi PCC dipikanyaho nyababkeun akumulasi toksik turunan propionil, kalebet asam propionat (PPA)23,24,25. PPA parantos dipidangkeun ngaganggu métabolisme neuronal sareng ngarobih paripolah in vivo sareng mangrupikeun modél sato anu parantos ditetepkeun pikeun nalungtik mékanisme neurodevelopmental anu kalibet dina ASD26,27,28. Salaku tambahan, PPA parantos dilaporkeun ngaganggu poténsi mémbran mitokondria, biogenesis sareng réspirasi in vitro sareng parantos seueur dianggo pikeun modél disfungsi mitokondria dina neuron29,30. Nanging, dampak disfungsi mitokondria anu diinduksi PPA kana morfologi sareng dinamika mitokondria masih kirang kahartos.
Panilitian ieu nganggo téknik pencitraan komplementer pikeun ngitung pangaruh PPA kana morfologi, dinamika, sareng fungsi mitokondria dina sél SH-SY5Y. Mimitina, urang ngembangkeun metode TEM pikeun ngabayangkeun parobahan dina morfologi sareng ultrastruktur mitokondria17,31,32. Kusabab sipat dinamis mitokondria33, urang ogé nganggo analisis localizer kajadian mitokondria (MEL) pikeun ngitung parobahan dina kasaimbangan antara kajadian fisi sareng fusi, jumlah sareng volume mitokondria dina setrés PPA. Pamungkas, urang nalungtik naha morfologi sareng dinamika mitokondria aya hubunganana sareng parobahan dina éksprési gén anu kalibet dina biogenesis, fisi, sareng fusi. Sacara gembleng, data urang ngagambarkeun tantangan pikeun ngajelaskeun kompleksitas mékanisme anu ngatur dinamika mitokondria. Urang nyorot mangpaat TEM dina nalungtik morfologi mitokondria salaku titik tungtung konvergen mitosis anu tiasa diukur dina sél SH-SY5Y. Salaku tambahan, urang nyorot yén data TEM nyayogikeun inpormasi anu paling beunghar nalika digabungkeun sareng téknik pencitraan anu ogé néwak kajadian dinamis salaku réspon kana setrés métabolik. Karakterisasi salajengna ngeunaan mékanisme pangaturan molekuler anu ngadukung mitosis sél neuronal tiasa nyayogikeun wawasan penting kana komponén mitokondria tina sistem saraf sareng panyakit neurodegeneratif.
Pikeun ngainduksi setrés mitokondria, sél SH-SY5Y dirawat ku PPA nganggo 3 mM sareng 5 mM natrium propionat (NaP). Sateuacan TEM, sampel dilakukeun persiapan sampel kriogenik nganggo pembekuan sareng pembekuan tekanan tinggi (Gambar 1a). Kami ngembangkeun pipa analisis gambar mitokondria otomatis pikeun ngukur dalapan parameter morfologis populasi mitokondria dina tilu réplikasi biologis. Kami mendakan yén perlakuan PPA sacara signifikan ngarobih opat parameter: daérah 2, daérah, perimeter, sareng diaméter Feret (Gambar 1b–e). Daérah 2 turun sacara signifikan sareng perlakuan PPA 3 mM sareng 5 mM (p = 0,0183 sareng p = 0,002, masing-masing) (Gambar 1b), sedengkeun daérah (p = 0,003), perimeter (p = 0,0106) sareng diaméter Feret sadayana turun sacara signifikan. Aya réduksi anu signifikan (p = 0,0172) dina kelompok perlakuan 5 mM dibandingkeun sareng kelompok kontrol (Gambar 1c–e). Pangurangan anu signifikan dina lega sareng keliling nunjukkeun yén sél anu dirawat ku 5 mM PPA ngagaduhan mitokondria anu langkung alit sareng langkung buleud, sareng mitokondria ieu kirang manjang tibatan anu aya dina sél kontrol. Ieu ogé saluyu sareng panurunan anu signifikan dina diaméter Feret, parameter mandiri anu nunjukkeun panurunan jarak panggedéna antara ujung partikel. Parobihan dina ultrastruktur krista dititénan: krista janten kirang jelas dina pangaruh setrés PPA (Gambar 1a, panel B). Nanging, henteu sadaya gambar sacara jelas ngagambarkeun ultrastruktur krista, janten analisis kuantitatif tina parobihan ieu henteu dilaksanakeun. Data TEM ieu tiasa ngagambarkeun tilu skénario anu mungkin: (1) PPA ningkatkeun fisi atanapi ngahambat fusi, nyababkeun mitokondria anu aya ngaleutikan ukuranana; (2) biogenesis anu ditingkatkeun nyiptakeun mitokondria énggal anu langkung alit atanapi (3) ngainduksi duanana mékanisme sacara simultan. Sanaos kaayaan ieu henteu tiasa dibédakeun ku TEM, parobihan morfologis anu signifikan nunjukkeun parobihan dina homeostasis sareng dinamika mitokondria dina setrés PPA. Kami salajengna ngajalajah parameter tambahan pikeun langkung ngajelaskeun dinamika ieu sareng mékanisme poténsial anu aya di handapeunna.
Asam propionat (PPA) ngarobih morfologi mitokondria. (a) Gambar mikroskop éléktron transmisi répréséntatif (TEM) anu nunjukkeun yén ukuran mitokondria ngirang sareng mitokondria janten langkung alit sareng langkung buleud kalayan ningkatna perlakuan PPA; 0 mM (henteu diubaran), 3 mM sareng 5 mM, masing-masing. Panah beureum nunjukkeun mitokondria. (b–e) Sél SH-SY5Y anu diubaran ku PPA salami 24 jam disiapkeun pikeun TEM sareng hasilna dianalisis nganggo Fiji/ImageJ. Opat tina dalapan parameter nunjukkeun béda anu signifikan antara sél kontrol (henteu diubaran, 0 mM PPA) sareng sél anu diubaran (3 mM sareng 5 mM PPA). (b) Daérah 2, (c) Area, (d) Perimeter, (e) Diaméter Feret. Analisis varian hiji arah (kontrol vs. perlakuan) sareng uji babandingan ganda Dunnett dianggo pikeun nangtukeun béda anu signifikan (p <0,05). Titik data ngagambarkeun nilai mitokondria rata-rata pikeun unggal sél individu, sareng bilah kasalahan ngagambarkeun rata-rata ± SEM. Data anu dipidangkeun ngagambarkeun n = 3, sahenteuna 24 sél per réplikasi; total 266 gambar dianalisis; * nunjukkeun p < 0,05, ** nunjukkeun p < 0,01.
Pikeun ngajelaskeun langkung jero kumaha dinamika mitokondria ngaréspon kana PPA, urang ngawarnaan mitokondria ku tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) sareng nganggo mikroskop time-lapse sareng analisis MEL pikeun melokalisasi sareng ngitung mitokondria saatos 24 jam dina 3 sareng 5 mM PPA. Perawatan kajadian fisi sareng fusi. (Gambar 2a). Saatos analisis MEL, mitokondria salajengna dianalisis pikeun ngitung jumlah struktur mitokondria sareng volume rata-rata na. Kami niténan paningkatan anu alit tapi signifikan dina jumlah kajadian fisi anu lumangsung dina 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] dibandingkeun sareng fisi [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] sareng kajadian fusi [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] sareng fusi [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] ningkat sacara signifikan dina 5 mM dibandingkeun sareng kontrol (Gambar 3b). Jumlah mitokondria ningkat sacara signifikan dina 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] sareng 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Gambar 3c), sedengkeun volume rata-rata unggal struktur mitokondria tetep teu robih (Gambar 3c). 3d). Sacara gembleng, ieu nunjukkeun yén remodeling dinamika mitokondria janten réspon kompensasi anu suksés ngajaga integritas jaringan mitokondria. Kanaékan jumlah kajadian fisi dina 3 mM PPA nunjukkeun yén paningkatan jumlah mitokondria sabagian kusabab fisi mitokondria, tapi kumargi volume mitokondria rata-rata tetep teu robih, biogenesis teu tiasa disingkirkeun salaku réspon kompensasi tambahan. Nanging, data ieu saluyu sareng struktur mitokondria anu langkung alit sareng buleud anu dititénan ku TEM sareng ogé nunjukkeun parobahan anu signifikan dina dinamika mitokondria anu diinduksi ku PPA.
Asam propionat (PPA) ngainduksi remodeling mitokondria dinamis pikeun ngajaga integritas jaringan. Sél SH-SY5Y dikultur, dirawat ku 3 sareng 5 mM PPA salami 24 jam sareng diwarnaan ku TMRE sareng Hoechst 33342 dituturkeun ku analisis MEL. (a) Gambar mikroskopi time-lapse anu ngagambarkeun warna sareng proyéksi inténsitas maksimum binarisasi dina waktos 2 (t2) pikeun unggal kaayaan. Daérah anu dipilih anu dituduhkeun dina unggal gambar binér ditingkatkeun sareng ditampilkeun dina 3D dina tilu pigura waktos anu béda (t1-t3) pikeun ngagambarkeun dinamika kana waktos; kajadian fusi disorot héjo; kajadian fisi disorot héjo. Ditampilkeun beureum. (b) Jumlah rata-rata kajadian dinamis per kaayaan. (c) Jumlah rata-rata struktur mitokondria per sél. (d) Volume rata-rata (µm3) tina unggal struktur mitokondria per sél. Data anu dipidangkeun ngawakilan n = 15 sél per grup perlakuan. Batang kasalahan anu dipidangkeun ngagambarkeun rata-rata ± SEM, batang skala = 10 μm, * p < 0,05.
Asam propionat (PPA) nyababkeun suprési transkripsi gén anu aya hubunganana sareng dinamika mitokondria. Sél SH-SY5Y dirawat ku 3 sareng 5 mM PPA salami 24 jam. Kuantifikasi gén relatif dilakukeun nganggo RT-qPCR sareng dinormalisasi ka B2M. Gén biogenesis mitokondria (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 sareng (d) NFE2L2. Gén fusi sareng fisi mitokondria (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 sareng (i) DRP1. Béda anu signifikan (p < 0,05) diuji nganggo ANOVA hiji arah (kontrol vs. perlakuan) sareng uji babandingan ganda Dunnett: * nunjukkeun p < 0,05, ** nunjukkeun p < 0,01, sareng **** nunjukkeun p < 0,0001. Batang ngagambarkeun éksprési rata-rata ± SEM. Data anu dipidangkeun ngagambarkeun n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), sareng n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) réplikasi biologis.
Data tina analisis TEM sareng MEL babarengan nunjukkeun yén PPA ngarobih morfologi sareng dinamika mitokondria. Nanging, téknik pencitraan ieu henteu masihan wawasan kana mékanisme anu mendasari anu ngadorong prosés ieu. Ku kituna, kami nalungtik éksprési mRNA tina salapan régulator konci dinamika mitokondria, biogenesis, sareng mitosis salaku réspon kana pangobatan PPA. Kami ngitung onkogen myeloma sél (cMYC), faktor pernapasan nuklir (NRF1), faktor transkripsi mitokondria 1 (TFAM), faktor transkripsi sapertos NFE2 BZIP (NFE2L2), protéin sapertos gastrin 2 (STOML2), atrofi saraf optik 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) sareng protéin anu aya hubunganana sareng dinamin 1 (DRP1) saatos 24 jam pangobatan nganggo 3 mM sareng 5 mM PPA. Kami niténan perlakuan PPA 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 sareng p < 0,0001, masing-masing) sareng 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Gambar 3a–c). Panurunan éksprési mRNA gumantung kana dosis: éksprési cMYC, NRF1 sareng TFAM turun 5,7, 2,6 sareng 1,9 kali dina 3 mM, masing-masing, sareng 11,2, 3 sareng 2,2 kali dina 5 mM. Sabalikna, gén biogenesis rédoks sentral NFE2L2 henteu robih dina konsentrasi PPA naon waé, sanaos tren anu sami gumantung kana dosis tina panurunan éksprési dititénan (Gambar 3d).
Kami ogé nalungtik éksprési gén klasik anu kalibet dina pangaturan fisi sareng fusi. STOML2 dianggap kalibet dina fusi, mitofagi sareng biogenesis, sareng éksprési na dikirangan sacara signifikan (p < 0,0001) ku 3 mM (parobahan 2,4 kali lipat) sareng 5 mM (parobahan 2,8 kali lipat) PPA (Gambar 1). 3d). Sarua, éksprési gén fusi OPA1 dikirangan dina 3 mM (parobahan 1,6 kali lipat) sareng 5 mM (parobahan 1,9 kali lipat) PPA (p = 0,006 sareng p = 0,0024, masing-masing) (Gambar 3f). Nanging, kami henteu mendakan béda anu signifikan dina éksprési gén fusi MFN1, MFN2 atanapi gén fisi DRP1 dina setrés PPA 24 jam (Gambar 3g–i). Salian ti éta, urang mendakan yén tingkat opat protéin fusi sareng fisi (OPA1, MFN1, MFN2 sareng DRP1) henteu robih dina kaayaan anu sami (Gambar 4a–d). Penting pikeun dicatet yén data ieu ngagambarkeun hiji titik dina waktos sareng panginten henteu ngagambarkeun parobahan dina éksprési protéin atanapi tingkat aktivitas salami tahap awal setrés PPA. Nanging, réduksi anu signifikan dina éksprési cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, sareng OPA1 nunjukkeun disregulasi transkripsi anu signifikan tina métabolisme mitokondria, biogenesis, sareng dinamika. Salaku tambahan, data ieu nyorot mangpaat téknik pencitraan pikeun langsung nalungtik parobahan kaayaan ahir dina fungsi mitokondria.
Kadar protéin fusi sareng faktor fisi henteu robih saatos perlakuan asam propionat (PPA). Sél SH-SY5Y dirawat ku 3 sareng 5 mM PPA salami 24 jam. Kadar protéin diukur ku analisis Western blot, sareng kadar éksprési dinormalisasi kana total protéin. Éksprési protéin rata-rata sareng Western blots anu ngawakilan protéin target sareng total dipidangkeun. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Batang ngagambarkeun rata-rata ± SEM, sareng data anu dipidangkeun ngawakilan n = 3 réplika biologis. Sababaraha babandingan (p < 0,05) dilakukeun nganggo analisis varian hiji arah sareng uji Dunnett. Gél sareng blot asli dipidangkeun dina Gambar S1.
Disfungsi mitokondria aya patalina jeung panyakit multisistem mimitian ti panyakit métabolik, kardiovaskular jeung otot nepi ka panyakit neurologis1,10. Seueur panyakit neurodegeneratif jeung neurodegeneratif aya patalina jeung disfungsi mitokondria, nu nunjukkeun pentingna organél ieu sapanjang umur uteuk. Panyakit ieu kaasup panyakit Parkinson, panyakit Alzheimer jeung ASD3,4,18. Sanajan kitu, aksés ka jaringan uteuk pikeun nalungtik panyakit ieu hésé, utamana dina tingkat mékanistik, sahingga sistem modél sélular jadi alternatif nu diperlukeun. Dina ieu panalungtikan, urang ngagunakeun sistem modél sélular nu ngagunakeun sél SH-SY5Y nu dirawat ku PPA pikeun ngarékapitasi disfungsi mitokondria nu dititénan dina panyakit neuronal, utamana gangguan spéktrum autisme. Ngagunakeun modél PPA ieu pikeun nalungtik dinamika mitokondria dina neuron bisa méré wawasan ngeunaan étiologi ASD.
Kami nalungtik kamungkinan ngagunakeun TEM pikeun ningali parobahan dina morfologi mitokondria. Penting pikeun dicatet yén TEM kedah dianggo kalayan leres pikeun maksimalkeun efektivitasna. Nyiapkeun spésimén krio ngamungkinkeun pikeun ngawétkeun struktur neuronal anu langkung saé ku cara ngalereskeun komponén sélular sacara simultan sareng ngirangan formasi artefak34. Saluyu sareng ieu, kami niténan yén sél SH-SY5Y anu sapertos neuron ngagaduhan organél subselular anu utuh sareng mitokondria anu manjang (Gambar 1a). Ieu nyorot mangpaat téknik persiapan kriogenik pikeun nalungtik morfologi mitokondria dina modél sél neuronal. Sanaos pangukuran kuantitatif penting pisan pikeun analisis obyektif data TEM, masih teu aya konsensus ngeunaan parameter khusus naon anu kedah diukur pikeun mastikeun parobahan morfologis mitokondria. Dumasar kana sajumlah ageung panilitian anu sacara kuantitatif nalungtik morfologi mitokondria17,31,32, kami ngembangkeun pipa analisis gambar mitokondria otomatis anu ngukur dalapan parameter morfologis, nyaéta: daérah, daérah2, rasio aspék, perimeter, sirkularitas, derajat, diaméter Feret, sareng bunderan.
Di antarana, PPA sacara signifikan ngirangan area 2, area, perimeter, sareng diaméter Feret (Gambar 1b–e). Ieu nunjukkeun yén mitokondria janten langkung alit sareng langkung buleud, anu saluyu sareng panilitian sateuacana anu nunjukkeun panurunan area mitokondria saatos 72 jam setrés mitokondria anu diinduksi PPA30. Fitur morfologis ieu tiasa nunjukkeun fisi mitokondria, prosés anu diperyogikeun pikeun ngasingkeun komponén anu ruksak tina jaringan mitokondria pikeun ngamajukeun degradasi na ngalangkungan mitophagy35,36,37. Di sisi anu sanés, panurunan ukuran mitokondria rata-rata tiasa aya hubunganana sareng ningkatna biogenesis, anu nyababkeun formasi mitokondria leutik anu nembé lahir. Ningkatna fisi atanapi biogenesis ngagambarkeun réspon kompensasi pikeun ngajaga mitosis ngalawan setrés mitokondria. Nanging, panurunan pertumbuhan mitokondria, fusi anu kaganggu, atanapi kaayaan sanésna henteu tiasa dikaluarkeun.
Sanaos gambar résolusi luhur anu didamel ku TEM ngamungkinkeun nangtukeun karakteristik morfologis dina tingkat mitokondria individu, metode ieu ngahasilkeun snapshot dua diménsi dina hiji titik waktos. Pikeun nalungtik réspon dinamis kana setrés métabolik, kami ngawarnaan mitokondria ku TMRE sareng nganggo mikroskop time-lapse kalayan analisis MEL, anu ngamungkinkeun visualisasi 3D throughput tinggi tina parobahan dina jaringan mitokondria kana waktosna33,38. Kami niténan parobahan anu halus tapi signifikan dina dinamika mitokondria dina setrés PPA (Gambar 2). Dina 3 mM, jumlah kajadian fisi ningkat sacara signifikan, sedengkeun kajadian fusi tetep sami sareng dina kontrol. Peningkatan jumlah kajadian fisi sareng fusi dititénan dina 5 mM PPA, tapi parobahan ieu ampir proporsional, nunjukkeun yén kinétika fisi sareng fusi ngahontal kasaimbangan dina konsentrasi anu langkung luhur (Gambar 2b). Volume mitokondria rata-rata tetep teu robih dina 3 sareng 5 mM PPA, nunjukkeun yén integritas jaringan mitokondria dijaga (Gambar 2d). Ieu ngagambarkeun kamampuan jaringan mitokondria dinamis pikeun ngaréspon setrés métabolik hampang pikeun ngajaga homeostasis sacara efektif tanpa nyababkeun fragmentasi jaringan. Dina 3 mM PPA, paningkatan fisi cekap pikeun ngamajukeun transisi kana kasaimbangan anyar, tapi diperyogikeun remodeling kinétik anu langkung jero salaku réspon kana setrés anu disababkeun ku konsentrasi PPA anu langkung luhur.
Jumlah mitokondria ningkat dina dua konsentrasi setrés PPA, tapi volume mitokondria rata-rata henteu robih sacara signifikan (Gambar 2c). Ieu tiasa disababkeun ku ningkatna biogenesis atanapi ningkatna divisi; kumaha oge, upami teu aya panurunan anu signifikan dina volume mitokondria rata-rata, langkung dipikaresep biosintésis ningkat. Nanging, data dina Gambar 2 ngadukung ayana dua mékanisme kompensasi: paningkatan jumlah kajadian fisi, saluyu sareng upregulasi fisi mitokondria, sareng paningkatan jumlah kajadian, saluyu sareng biogenesis mitokondria. Pamustunganana, kompensasi dinamis pikeun setrés hampang tiasa diwangun ku prosés simultan anu ngalibatkeun fisi, fusi, biogenesis, sareng mitofagi. Sanaos panulis sateuacana parantos nunjukkeun yén PPA ningkatkeun mitosis30,39 sareng mitofagi29, kami nyayogikeun bukti pikeun remodeling dinamika fisi sareng fusi mitokondria salaku réspon kana PPA. Data ieu mastikeun parobahan morfologis anu dititénan ku TEM sareng nyayogikeun wawasan salajengna kana mékanisme anu aya hubunganana sareng disfungsi mitokondria anu diinduksi PPA.
Kusabab analisis TEM atanapi MEL henteu nyayogikeun bukti langsung ngeunaan mékanisme pangaturan gén anu aya dina parobahan morfologis anu dititénan, kami nalungtik éksprési RNA gén anu kalibet dina métabolisme mitokondria, biogenesis, sareng dinamika. Proto-onkogén cMYC mangrupikeun faktor transkripsi anu kalibet dina pangaturan mitokondria, glikolisis, asam amino sareng métabolisme asam lemak40. Salaku tambahan, cMYC dipikanyaho ngatur éksprési ampir 600 gén mitokondria anu kalibet dina transkripsi, tarjamahan, sareng perakitan kompléks mitokondria, kalebet NRF1 sareng TFAM41. NRF1 sareng TFAM mangrupikeun dua régulator sentral mitosis, anu bertindak di hilir PGC-1α pikeun ngaktipkeun réplikasi mtDNA. Jalur ieu diaktipkeun ku sinyal cAMP sareng AMPK sareng sénsitip kana panggunaan énergi sareng setrés métabolik. Kami ogé nalungtik NFE2L2, régulator rédoks biogenesis mitokondria, pikeun nangtukeun naha pangaruh PPA tiasa dimediasi ku setrés oksidatif.
Sanaos éksprési NFE2L2 tetep teu robih, kami mendakan panurunan anu konsisten gumantung kana dosis dina éksprési cMYC, NRF1 sareng TFAM saatos 24 jam pangobatan nganggo 3 mM sareng 5 mM PPA (Gambar 3a–c). Downregulation éksprési cMYC sateuacanna parantos dilaporkeun salaku réspon kana setrés mitokondria42, sareng sabalikna, downregulation éksprési cMYC tiasa nyababkeun disfungsi mitokondria ku cara ngarobih métabolisme mitokondria, konéktivitas jaringan, sareng polarisasi mémbran43. Anu pikaresepeun, cMYC ogé kalibet dina pangaturan fisi sareng fusi mitokondria42,43 sareng dipikanyaho ningkatkeun fosforilasi DRP1 sareng lokalisasi mitokondria salami divisi sél44, ogé ngamediasi remodeling morfologis mitokondria dina sél stém neuronal45. Memang, fibroblas anu kakurangan cMYC nunjukkeun ukuran mitokondria anu dikirangan, saluyu sareng parobihan anu diinduksi ku setrés PPA43. Data ieu ngagambarkeun hubungan anu pikaresepeun tapi tacan jelas antara cMYC sareng dinamika mitokondria, nyayogikeun target anu pikaresepeun pikeun panilitian ka hareup ngeunaan remodeling anu diinduksi setrés PPA.
Pangurangan NRF1 sareng TFAM saluyu sareng peran cMYC salaku aktivator transkripsi anu penting. Data ieu ogé saluyu sareng panilitian sateuacana dina sél kanker usus besar manusa anu nunjukkeun yén PPA ngirangan éksprési mRNA NRF1 dina 22 jam, anu aya hubunganana sareng panurunan ATP sareng ningkatna ROS46. Panulis ieu ogé ngalaporkeun yén éksprési TFAM ningkat dina 8,5 jam tapi uih deui ka tingkat dasar dina 22 jam. Sabalikna, Kim et al. (2019) nunjukkeun yén éksprési mRNA TFAM turun sacara signifikan saatos 4 jam setrés PPA dina sél SH-SY5Y; kumaha oge, saatos 72 jam, éksprési protéin TFAM ningkat sacara signifikan sareng jumlah salinan mtDNA ningkat sacara signifikan. Ku kituna, panurunan jumlah gén biogenesis mitokondria anu urang titénan saatos 24 jam henteu ngaluarkeun kamungkinan yén paningkatan jumlah mitokondria aya hubunganana sareng aktivasi biogenesis dina titik waktos anu langkung awal. Panilitian samemehna nunjukkeun yén PPA sacara signifikan ningkatkeun mRNA sareng protéin PGC-1α dina sél SH-SY5Y dina 4 jam 30 menit, sedengkeun asam propionat ningkatkeun biogenesis mitokondria dina hepatosit anak sapi via PGC-1α dina 12 jam 39 menit. Anu pikaresepeun, PGC-1α henteu ngan ukur régulator transkripsi langsung NRF1 sareng TFAM, tapi ogé parantos dipidangkeun pikeun ngatur aktivitas MFN2 sareng DRP1 ku cara ngatur fisi sareng fusi47. Sacara gembleng, ieu nyorot gandengan anu raket antara mékanisme anu ngatur réspon kompensasi mitokondria anu diinduksi ku PPA. Leuwih ti éta, data kami ngagambarkeun disregulasi anu signifikan tina régulasi transkripsi biogenesis sareng métabolisme dina setrés PPA.
Gén STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 sareng DRP1 mangrupikeun salah sahiji régulator sentral fisi, fusi sareng dinamika mitokondria37,48,49. Aya seueur gén sanés anu kalibet dina dinamika mitokondria, kumaha ogé, STOML2, OPA1 sareng MFN2 sateuacanna parantos kapendak dimetilasi sacara béda dina kohort ASD,16 sareng sababaraha panilitian mandiri parantos ngalaporkeun parobahan dina faktor transkripsi ieu salaku réspon kana setrés mitokondria50,51. 52. Éksprési OPA1 sareng STOML2 dikirangan sacara signifikan ku perlakuan PPA 3 mM sareng 5 mM (Gambar 3e, f). OPA1 mangrupikeun salah sahiji régulator klasik fusi mitokondria ngalangkungan interaksi langsung sareng MFN1 sareng 2 sareng maénkeun peran dina remodeling krista sareng morfologi mitokondria53. Peran pasti STOML2 dina dinamika mitokondria masih teu jelas, tapi bukti nunjukkeun yén éta maénkeun peran dina fusi mitokondria, biogenesis, sareng mitofagi.
STOML2 kalibet dina ngajaga gandéngan pernapasan mitokondria sareng formasi kompleks ranté pernapasan54,55 sareng parantos kabuktosan ngarobih sacara signifikan karakteristik métabolik sél kanker56. Panilitian nunjukkeun yén STOML2 ningkatkeun poténsi mémbran mitokondria sareng biogenesis ngalangkungan interaksi sareng BAN sareng cardiolipin55, 57, 58. Salaku tambahan, panilitian mandiri nunjukkeun yén interaksi antara STOML2 sareng PINK1 ngatur mitophagy59,60. Khususna, STOML2 parantos dilaporkeun langsung berinteraksi sareng ngastabilkeun MFN2 sareng ogé maénkeun peran penting dina ngastabilkeun isoform OPA1 anu panjang ku cara ngahambat protéase anu tanggung jawab pikeun degradasi OPA153,61,62. Pangurangan éksprési STOML2 anu dititénan dina réaksi PPA tiasa ngajantenkeun protéin fusi ieu langkung rentan ka degradasi ngalangkungan jalur anu gumantung kana ubiquitin sareng protéasom48. Sanaos peran pasti STOML2 sareng OPA1 dina réspon dinamis kana PPA teu acan jelas, turunna éksprési gén fusi ieu (Gambar 3) tiasa ngaganggu kasaimbangan antara fisi sareng fusi sareng nyababkeun turunna ukuran mitokondria (Gambar 3). 1).
Di sisi séjén, éksprési protéin OPA1 tetep teu robah saatos 24 jam, sedengkeun tingkat mRNA sareng protéin MFN1, MFN2 atanapi DRP1 henteu robih sacara signifikan saatos perlakuan PPA (Gambar 3g-i, Gambar 4). Ieu tiasa nunjukkeun yén teu aya parobihan dina pangaturan faktor-faktor ieu anu kalibet dina fusi sareng fisi mitokondria. Nanging, perlu dicatet yén masing-masing tina opat gén ieu ogé diatur ku modifikasi posttranskripsi (PTM) anu ngontrol aktivitas protéin. OPA1 gaduh dalapan varian sambatan alternatif anu dibeulah sacara protéolitik dina mitokondria pikeun ngahasilkeun dua isoform anu béda 63. Kasaimbangan antara isoform panjang sareng pondok pamustunganana nangtukeun peran OPA1 dina fusi mitokondria sareng pangropéa jaringan mitokondria 64. Aktivitas DRP1 diatur ku fosforilasi protéin kinase II (CaMKII) anu gumantung kana kalsium/kalmodulin, sedengkeun degradasi DRP1 diatur ku ubiquitination sareng SUMOylation 65. Pamungkas, duanana DRP1 sareng MFN1/2 mangrupikeun GTPase, janten kagiatan tiasa dipangaruhan ku laju produksi GTP dina mitokondria 66. Ku alatan éta, sanaos éksprési protéin ieu tetep konstan, ieu panginten henteu ngagambarkeun kagiatan protéin atanapi lokalisasi anu teu robih 67,68. Memang, repertoar protéin PTM anu tos aya sering janten garis pertahanan munggaran anu tanggung jawab pikeun ngamediasi réspon setrés akut. Dina ayana setrés métabolik sedeng dina modél urang, kamungkinan PTM ngamajukeun paningkatan kagiatan protéin fusi sareng fisi pikeun mulangkeun integritas mitokondria sacara cekap tanpa meryogikeun aktivasi tambahan tina gén ieu dina tingkat mRNA atanapi protéin.
Sacara gembleng, data di luhur nyorot pangaturan morfologi mitokondria anu rumit sareng gumantung kana waktos sareng tantangan pikeun ngajelaskeun mékanisme ieu. Pikeun nalungtik éksprési gén, mimitina perlu pikeun ngaidentipikasi gén target khusus dina jalur éta. Nanging, data kami nunjukkeun yén gén dina jalur anu sami henteu ngaréspon ku cara anu sami kana setrés anu sami. Nyatana, panilitian sateuacana parantos nunjukkeun yén gén anu béda dina jalur anu sami tiasa nunjukkeun profil réspon temporal anu béda30,46. Salaku tambahan, aya mékanisme pasca-transkripsi anu rumit anu ngaganggu hubungan antara transkripsi sareng fungsi gén. Panilitian protéomik tiasa masihan wawasan ngeunaan dampak PTM sareng fungsi protéin, tapi éta ogé nimbulkeun tantangan kalebet metode throughput anu handap, rasio signal-to-noise anu luhur, sareng résolusi anu goréng.
Dina kontéks ieu, nalungtik morfologi mitokondria nganggo TEM sareng MEL gaduh poténsi anu ageung pikeun ngajawab patarosan dasar ngeunaan hubungan antara dinamika sareng fungsi mitokondria sareng kumaha ieu mangaruhan panyakit. Anu paling penting, TEM nyayogikeun metode langsung pikeun ngukur morfologi mitokondria salaku titik tungtung konvergen tina disfungsi sareng dinamika mitokondria51. MEL ogé nyayogikeun metode langsung pikeun ngabayangkeun kajadian fisi sareng fusi dina lingkungan sélular tilu diménsi, anu ngamungkinkeun kuantifikasi remodeling mitokondria dinamis bahkan tanpa aya parobahan dina éksprési gén33. Di dieu urang nyorot mangpaat téknik pencitraan mitokondria dina panyakit mitokondria sekundér. Panyakit ieu biasana dicirikeun ku setrés métabolik hampang kronis anu dicirikeun ku remodeling jaringan mitokondria anu halus tinimbang karusakan mitokondria akut. Nanging, kompensasi mitokondria anu diperyogikeun pikeun ngajaga mitosis dina setrés kronis gaduh akibat fungsional anu jero. Dina kontéks neurosains, pamahaman anu langkung saé ngeunaan mékanisme kompensasi ieu tiasa nyayogikeun inpormasi penting ngeunaan neuropatologi pleiotropik anu aya hubunganana sareng disfungsi mitokondria.
Pamustunganana, data kami nyorot mangpaat téknik pencitraan pikeun ngartos akibat fungsional tina interaksi kompléks antara éksprési gén, modifikasi protéin, sareng aktivitas protéin anu ngontrol dinamika mitokondria neuronal. Kami nganggo PPA pikeun modél disfungsi mitokondria dina modél sél neuronal pikeun kéngingkeun wawasan ngeunaan komponén mitokondria ASD. Sél SH-SY5Y anu dirawat ku PPA nunjukkeun parobahan dina morfologi mitokondria: mitokondria janten alit sareng buleud, sareng krista kirang didefinisikeun nalika dititénan ku TEM. Analisis MEL nunjukkeun yén parobahan ieu lumangsung babarengan sareng paningkatan kajadian fisi sareng fusi pikeun ngajaga jaringan mitokondria salaku réspon kana setrés métabolik hampang. Leuwih ti éta, PPA sacara signifikan ngaganggu régulasi transkripsi métabolisme sareng homeostasis mitokondria. Kami ngaidentipikasi cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, sareng OPA1 salaku régulator mitokondria konci anu kaganggu ku setrés PPA sareng tiasa maénkeun peran dina ngamediasi parobahan anu diinduksi PPA dina morfologi sareng fungsi mitokondria. Panilitian ka hareup diperyogikeun pikeun ngajelaskeun parobahan temporal anu diinduksi PPA dina éksprési gén sareng aktivitas protéin, lokalisasi, sareng modifikasi pasca-translasi. Data kami nyorot kompleksitas sareng saling gumantungna mékanisme pangaturan anu ngamediasi réspon setrés mitokondria sareng nunjukkeun mangpaatna TEM sareng téknik pencitraan sanésna pikeun studi mékanistik anu langkung tertarget.
Garis sél SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) dipésér ti Sigma-Aldrich. Sél SH-SY5Y dipelak dina campuran nutrisi sedeng/F-12 Eagle anu dimodifikasi Dulbecco (DMEM/F-12) sareng L-glutamin (SC09411, ScienCell) dina labu 25 cm2 anu ditambahan ku 20% sérum sapi fétal (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) sareng 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) dina suhu 37 °C, 5% CO2. Sél-sél disubkultur nepi ka 80% konfluénsi nganggo 0,05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), disentrifugasi dina 300 g sareng dilapis dina kapadetan sakitar 7 × 105 sél/ml. Sadaya ékspérimén dilaksanakeun dina sél SH-SY5Y anu teu dibédakeun antara petikan 19–22. PPA dikaluarkeun salaku NaP. Larutkeun bubuk NaP (CAS No. 137-40-6, rumus kimia C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) dina cai MilliQ haneut dugi ka konsentrasi 1 M sareng simpen dina suhu 4 °C. Dina dinten pangobatan, éncérkeun larutan ieu ku 1 M PPA kana 3 mM sareng 5 mM PPA dina média bébas sérum (DMEM/F-12 sareng L-glutamin). Konsentrasi pangobatan pikeun sadaya ékspérimén nyaéta tanpa PPA (0 mM, kontrol), 3 mM, sareng 5 mM PPA. Ékspérimén dilaksanakeun sahenteuna dina tilu réplikasi biologis.
Sél SH-SY5Y dibibitkeun kana labu 25 cm5 kalayan laju 5,5 × 105 sél/ml teras dipelak salami 24 jam. Perlakuan PPA ditambahkeun kana labu sateuacan 24 jam inkubasi. Kumpulkeun pelet sél nuturkeun protokol subkultur jaringan mamalia normal (dijelaskeun di luhur). Suspénsikeun deui pelet sél dina 100 µl 2,5% glutaraldehida, 1 × PBS teras simpen dina suhu 4 °C dugi ka diprosés. Sél SH-SY5Y disentrifugasi sakedap pikeun ngabentuk pelet sél sareng miceun 2,5% glutaraldehida, 1 × larutan PBS. Suspénsikeun deui sedimen dina gél agarosa 4% anu disiapkeun dina cai sulingan (babandingan volume agarosa sareng sedimen nyaéta 1:1). Potongan agarosa disimpen dina grid dina pelat datar teras dilapis ku 1-heksadeséna sateuacan dibekukeun dina tekanan tinggi. Sampel dibekukeun dina 100% aseton garing dina -90 °C salami 24 jam. Suhu teras naék ka -80°C sareng larutan 1% osmium tetroksida sareng 0,1% glutaraldehida ditambahkeun. Sampel disimpen dina suhu -80°C salami 24 jam. Saatos ieu, suhu laun-laun naék ka suhu kamar salami sababaraha dinten: ti –80 °C dugi ka –50 °C salami 24 jam, ka –30 °C salami 24 jam, ka –10 °C salami 24 jam sareng pamungkas ka suhu kamar.
Saatos persiapan kriogenik, sampel diresapi ku résin sareng bagian anu ipis pisan (∼100 nm) didamel nganggo ultramicrotome Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Bagian-bagian diwarnaan ku uranil asetat 2% sareng timbal sitrat. Sampel dititénan nganggo mikroskop éléktron transmisi FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (sateuacanna FEI), Eindhoven, Walanda) anu beroperasi dina 200 kV (pemancar Lab6) sareng kaméra CCD Gatan (Gatan, Inggris) anu dilengkepan ku filter énergi Tridiem.
Dina unggal réplikasi téknis, sahenteuna 24 gambar sél tunggal diala, pikeun total 266 gambar. Sadaya gambar dianalisis nganggo makro Wilayah Minat (ROI) sareng makro Mitokondria. Makro mitokondria dumasar kana metode anu diterbitkeun17,31,32 sareng ngamungkinkeun pamrosésan batch semi-otomatis gambar TEM di Fiji/ImageJ69. Singkatna: gambar dibalikkeun sareng dibalikkeun nganggo pangurangan latar tukang bal gulung (radius 60 piksel) sareng filter bandpass FFT (nganggo wates luhur sareng handap 60 sareng 8 piksel masing-masing) sareng suprési garis vertikal kalayan toleransi orientasi 5%. Gambar anu diprosés sacara otomatis diwatesan nganggo algoritma entropi maksimum sareng topéng binér dihasilkeun. Daérah gambar anu aya hubunganana sareng ROI anu dipilih sacara manual dina gambar TEM atah diekstrak, ngacirikeun mitokondria sareng ngaluarkeun mémbran plasma sareng daérah kontras tinggi anu sanés. Pikeun unggal ROI anu diekstrak, partikel binér anu langkung ageung tibatan 600 piksel dianalisis, sareng luas partikel, perimeter, sumbu mayor sareng minor, diaméter Feret, bunderan, sareng sirkularitas diukur nganggo fungsi pangukuran bawaan Fiji/ImageJ. Saatos Merrill, Flippo, sareng Strack (2017), luas 2, babandingan aspék partikel (babandingan sumbu mayor ka minor), sareng faktor bentuk (FF) diitung tina data ieu, dimana FF = perimeter 2/4pi x luas. Définisi rumus parametrik tiasa dipendakan dina Merrill, Flippo, sareng Strack (2017). Makro anu disebatkeun sayogi dina GitHub (tingali Pernyataan Kasadiaan Data). Rata-rata, sakitar 5.600 partikel dianalisis per perlakuan PPA, pikeun total sakitar 17.000 partikel (data henteu dipidangkeun).
Sél SH-SH5Y ditempatkeun dina piring kultur 8-ruang (ThermoFisher, #155411) pikeun ngamungkinkeun adhesi sapeuting teras diinkubasi ku TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) sareng Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). pewarnaan. Gambar diala nganggo laser 405 nm sareng 561 nm salami lingkungan 10 menit, sareng gambar atah diala salaku tumpukan-z anu ngandung 10 mikrograf gambar kalayan léngkah az 0,2 μm antara pigura gambar dina 12 titik waktu salajengna. Gambar dikumpulkeun nganggo platform super-résolusi Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman) nganggo lensa LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Gambar dianalisis dina ImageJ nganggo pipa anu parantos dijelaskeun sateuacanna sareng plugin ImageJ pikeun ngukur kajadian fusi sareng fisi, jumlah rata-rata struktur mitokondria, sareng volume mitokondria rata-rata per sél33. Makro MEL sayogi dina GitHub (tingali Pernyataan Kasadiaan Data).
Sél SH-SY5Y dipelak dina genep sumur pelat kalayan kapadetan 0,3 × 106 sél/mL salami 24 jam sateuacan dirawat. RNA diekstrak nganggo protokol Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) kalayan modifikasi sakedik: tambahkeun 300 μl buffer lisis RNA kana unggal sumur sateuacan dipiceun sareng lisis unggal sampel salaku léngkah terakhir nganggo 30 μl élusi DNase/RNase. -cai bébas. Sadaya sampel dipariksa kuantitas sareng kualitasna nganggo Spektrofotometer UV-Vis NanoDrop ND-1000. Total protéin tina lisat sél diala nganggo 200 μl buffer lisis RIPA, sareng konsentrasi protéin diukur nganggo uji protéin Bradford70.
Sintésis cDNA dilaksanakeun nganggo Kit Sintésis cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) numutkeun pitunjuk produsén kalayan sababaraha modifikasi. cDNA disintésis dina réaksi 20-μl nganggo 0,7 dugi ka 1 μg total RNA. Primer dipilih tina makalah anu parantos diterbitkeun sateuacanna 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabel S1) sareng probe anu ngalengkepan dirancang nganggo alat PrimerQuest ti Integrated DNA Technologies. Sadaya gén anu dipikaresep dinormalisasi kana gén B2M nuklir. Éksprési gén STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC sareng OPA1 diukur ku RT-qPCR. Campuran master ngawengku LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM primer maju sareng mundur, cDNA, sareng cai kelas PCR pikeun ngahasilkeun volume ahir 10 μL pikeun unggal réaksi. Éksprési gén divisi sareng fisi (DRP1, MFN1/2) diukur nganggo uji multipleks TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) dianggo numutkeun pitunjuk produsén kalayan modifikasi sakedik. Campuran master RT-qPCR multipleks ngawengku 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM primer maju sareng mundur, 10 μM probe, cDNA, sareng cai kelas PCR, ngahasilkeun volume ahir 20 μL pikeun unggal réaksi. RT-qPCR dilaksanakeun nganggo Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nomer séri: R0618110). Kaayaan siklus dipidangkeun dina Tabel S1. Sadaya sampel cDNA diamplifikasi dina rangkep tilu sareng kurva standar dihasilkeun nganggo runtuyan pengenceran sapuluh kali lipat. Outlier dina sampel rangkep tilu kalayan simpangan baku siklus (Ct) >0,5 dihapus tina analisis pikeun mastikeun réproduktibilitas data30,72. Éksprési gén relatif diitung nganggo metode 2-ΔΔCt79.
Sampel protéin (60 μg) dicampur sareng Laemmli loading buffer dina babandingan 2:1 sareng dijalankeun dina gél protéin teu warnaan 12% (Bio-Rad #1610184). Protéin dipindahkeun ka mémbran PVDF (polivinilidena fluorida) (#170-84156, Bio-Rad) nganggo sistem Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Mémbran diblokir sareng diinkubasi ku antibodi primér anu pas (OPA1, MFN1, MFN2, sareng DRP1) (diéncérkeun 1:1000) salami 48 jam, dituturkeun ku inkubasi ku antibodi sekundér (1:10.000) salami 1 jam. Mémbran teras dicitra nganggo Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) sareng dirékam nganggo sistem Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab versi 6.1 dianggo pikeun analisis Western blot. Gél sareng blot aslina dipidangkeun dina Gambar S1. Inpormasi antibodi disayogikeun dina Tabel S2.
Set data dipidangkeun salaku rata-rata sareng kasalahan standar tina rata-rata (SEM) sahenteuna tilu sampel mandiri. Set data diuji normalitas nganggo uji Shapiro-Wilks (kajaba upami dinyatakeun sanés) sateuacan nganggap distribusi Gaussian sareng standar deviasi anu sami sareng neraskeun analisis. Salian ti nganalisis set data nganggo Fisher's MEL LSD (p < 0,05), ANOVA hiji arah (rata-rata perlakuan vs. kontrol), sareng uji babandingan ganda Dunnett pikeun nangtukeun signifikansi (p < 0,05). Nilai p anu signifikan dipidangkeun dina grafik salaku *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Sadaya analisis statistik sareng grafik dilakukeun sareng dihasilkeun nganggo GraphPad Prism 9.4.0.
Makro Fiji/ImageJ pikeun analisis gambar TEM sayogi kanggo umum di GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) sayogi kanggo umum di GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM sareng Vijaya A. Mitokondria: pangatur utama métabolisme, homeostasis, setrés, sepuh sareng epigenetik. Basa Indonésia. Élmu Biomédis. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfungsi mitokondria multifaset dina skizofrenia, kompleks I salaku target patologis anu mungkin. Skizofrenia. sumber daya. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. sareng Beal, MF Disfungsi mitokondria dina panyakit Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG sareng Mehta V. Mitokondria anu setrés: target invasi dina panyakit Alzheimer. Mitokondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF sareng Ferreira GK Mitokondria sareng uteuk: bioénergi sareng seueur deui. Neurotoksin. sumber daya. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondria pleiotropik: dampak mitokondria kana kamekaran neuronal sareng panyakit. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. sareng Morais, VA Biogenesis mitokondria dina neuron: kumaha sareng dimana. internasionalitas. J. Mohr. élmu. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. sareng Zhao, J. Pangaturan dinamika mitokondria mamalia: kasempetan sareng tantangan. payun. éndokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. sareng Slack, RS Dinamika mitokondria dina pangaturan neurogenesis: ti perkembangan otak dugi ka déwasa. perkembangan. dinamis. 247, 47–53 (2018).