Ayeuna *Alamat ayeuna: Cologne 50931, Jerman, Panalungtikan Klaster Kaunggulan Cologne ngeunaan Réspon Setrés Sélulér dina Panyakit anu Patali sareng Sepuh (CECAD).
Neurodegenerasi panyakit mitokondria dianggap teu tiasa dibalikkeun deui sabab plastisitas métabolik neuron diwatesan, tapi pangaruh disfungsi mitokondria kana otonomi sél métabolisme neuronal dina awak kurang kahartos. Di dieu, urang ngenalkeun protéom spésifik sél tina neuron Purkinje kalayan kakurangan OXPHOS progresif anu disababkeun ku dinamika fusi mitokondria anu kaganggu. Kami mendakan yén disfungsi mitokondria micu parobahan anu ageung dina widang protéomik, anu pamustunganana nyababkeun aktivasi sekuensial program métabolik anu tepat sateuacan maot sél. Tanpa disangka-sangka, urang nangtukeun induksi anu jelas tina piruvat karboksilase (PCx) sareng énzim anti-sepuh sanés anu nambihan zat antara siklus TCA. Inhibisi PCx ngagedekeun setrés oksidatif sareng neurodegenerasi, nunjukkeun yén aterosklerosis gaduh pangaruh pelindung dina neuron anu kakurangan OXPHOS. Pamulihan fusi mitokondria dina neuron anu degenerasi terminal ngabalikeun deui ciri métabolik ieu, sahingga nyegah maot sél. Panemuan kami ngaidentipikasi jalur anu sateuacanna teu dipikanyaho anu masihan résiliénsi kana disfungsi mitokondria sareng nunjukkeun yén neurodegenerasi tiasa dibalikkeun bahkan dina tahap akhir panyakit.
Peran sentral mitokondria dina ngajaga métabolisme énergi neuronal ditekenkeun ku gejala neurologis anu éksténsif anu aya hubunganana sareng panyakit mitokondria manusa. Kaseueuran panyakit ieu disababkeun ku mutasi gén anu ngatur éksprési gén mitokondria (1, 2) atanapi karusakan gén anu aya hubunganana sareng dinamika mitokondria, anu sacara teu langsung mangaruhan stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Panilitian dina modél sato parantos nunjukkeun yén salaku réspon kana disfungsi mitokondria dina jaringan sakurilingna, jalur métabolik konservatif (5-7) tiasa diaktipkeun, anu nyayogikeun inpormasi penting pikeun pamahaman anu jero ngeunaan patogenesis panyakit anu rumit ieu. Sabalikna, pamahaman urang ngeunaan parobahan métabolik tina jinis sél khusus anu disababkeun ku kagagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak mangrupikeun dasar (8), nekenkeun kabutuhan pikeun ngaidentipikasi target terapi anu tiasa dianggo pikeun nyegah atanapi nyegah panyakit. Nyegah neurodegenerasi (9). Kurangna inpormasi nyaéta kanyataan yén sél saraf sacara lega dianggap gaduh kalenturan métabolik anu terbatas pisan dibandingkeun sareng jinis sél jaringan sakurilingna (10). Kusabab sél-sél ieu maénkeun peran sentral dina koordinasi suplai metabolit ka neuron pikeun ngamajukeun transmisi sinaptik sareng ngaréspon kana kaayaan tatu sareng panyakit, kamampuan pikeun nyaluyukeun métabolisme sél kana kaayaan jaringan otak anu nangtang ampir diwatesan ku sél glial (11-14). Salian ti éta, hétérogénitas sélular anu aya dina jaringan otak sacara ageung ngahalangan panilitian parobahan métabolik anu lumangsung dina subgrup neuronal khusus. Hasilna, saeutik anu dipikanyaho ngeunaan akibat sélular sareng métabolik anu pasti tina disfungsi mitokondria dina neuron.
Pikeun ngartos akibat métabolik tina disfungsi mitokondria, kami ngasingkeun neuron Purkinje (PN) dina tahapan neurodegenerasi anu béda-béda anu disababkeun ku karusakan fusi mémbran luar mitokondria (Mfn2). Sanaos mutasi Mfn2 dina manusa aya hubunganana sareng bentuk neuropati sensorik motor turun-tumurun anu dikenal salaku Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), karusakan kondisional Mfn2 dina beurit mangrupikeun metode disfungsi induksi oksidasi Fosforilasi (OXPHOS) anu dikenal. Rupa-rupa subtipe neuronal (16-19) sareng fenotipe neurodegeneratif anu dihasilkeun dibarengan ku gejala neurologis progresif, sapertos gangguan gerakan (18, 19) atanapi ataksia cerebellar (16). Ku ngagunakeun kombinasi proteomik kuantitatif bébas labél (LFQ), metabolomik, pencitraan, sareng metode virologis, kami nunjukkeun yén neurodegenerasi progresif sacara kuat ngainduksi piruvat karboksilase (PCx) sareng faktor-faktor sanés anu kalibet dina arteriosklerosis PN in vivo Éksprési énzim. Pikeun mastikeun relevansi panemuan ieu, kami sacara khusus nurunkeun éksprési PCx dina PN anu kakurangan Mfn2, sareng mendakan yén operasi ieu nganyenyerikeun setrés oksidatif sareng ngagancangkeun neurodegenerasi, sahingga ngabuktikeun yén azoospermia masihan maot sél. Adaptabilitas métabolik. Éksprési MFN2 anu parah tiasa nyalametkeun PN degenerasi terminal kalayan kakurangan OXPHOS anu parah, konsumsi DNA mitokondria anu masif, sareng jaringan mitokondria anu sigana rusak, anu langkung nekenkeun yén bentuk neurodegenerasi ieu bahkan tiasa pulih dina tahap lanjut panyakit sateuacan maot sél.
Pikeun ngabayangkeun mitokondria dina knockout PN Mfn2, kami nganggo galur beurit anu ngamungkinkeun mitokondria anu gumantung kana Cre pikeun narékahan éksprési protéin fluoresensi konéng (YFP) (mtYFP) (20) Cre sareng mariksa morfologi mitokondria in vivo. Kami mendakan yén karusakan gén Mfn2 dina PN bakal nyababkeun pamisahan jaringan mitokondria sacara laun (Gambar S1A), sareng parobahan pangheubeulna kapanggih dina umur 3 minggu. Sabalikna, degenerasi anu substansial tina lapisan sél PN, sakumaha dibuktikeun ku leungitna imunostaining Calbindin, henteu dimimitian dugi ka umur 12 minggu (Gambar 1, A sareng B). Ketidakcocokan waktos antara parobahan pangheubeulna dina morfologi mitokondria sareng awal maot neuronal anu katingali ngadorong kami pikeun nalungtik parobahan métabolik anu dipicu ku disfungsi mitokondria sateuacan maot sél. Kami ngembangkeun strategi dumasar kana fluoresensi-activated cell sorting (FACS) pikeun ngasingkeun PN anu ngébréhkeun YFP (YFP+) (Gambar 1C), sareng dina beurit kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), salajengna disebut CTRL (Gambar S1B). Optimalisasi strategi gating dumasar kana inténsitas relatif sinyal YFP ngamungkinkeun kami pikeun ngamurnikeun awak YFP+ (YFPhigh) tina PN tina non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) atanapi fragmen akson/déndritik fluoresensi putatif (YFPlow; Gambar S1D, kénca), dikonfirmasi ku mikroskop confocal (Gambar S1D, katuhu). Pikeun mastikeun idéntitas populasi anu diklasifikasikeun, kami ngalaksanakeun protéomik LFQ teras analisis komponén utama, sareng mendakan yén aya pamisahan anu jelas antara sél YFPhigh sareng YFPneg (Gambar S1C). Sél YFPhigh némbongkeun pangayaan bersih tina spidol PN anu dipikanyaho (contona Calb1, Pcp2, Grid2 sareng Itpr3) (21, 22), tapi teu aya pangayaan protéin anu umumna diekspresikeun dina neuron atanapi jinis sél sanés (Gambar 1D)). Babandingan antara sampel dina sél YFPhigh anu diklasifikasikeun anu dikumpulkeun dina ékspérimén mandiri némbongkeun koéfisién korélasi> 0,9, nunjukkeun réproduktibilitas anu saé antara réplikasi biologis (Gambar S1E). Singkatna, data ieu ngavalidasi rencana kami pikeun isolasi akut sareng spésifik tina PN anu layak. Kusabab sistem supir L7-cre anu dianggo ngainduksi rekombinasi mosaik dina minggu kahiji saatos ngalahirkeun (23), kami mimiti miceun beurit tina CTRL sareng kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kumpulkeun neuron. Saatos rekombinasi réngsé, éta disebut Mfn2cKO dina umur 4 minggu. Salaku titik ahir, urang milih umur 8 minggu nalika lapisan PN masih utuh sanaos fragmentasi mitokondria anu jelas (Gambar 1B sareng Gambar S1A). Sacara total, urang ngitung total 3013 protéin, anu sakitar 22% dumasar kana anotasi MitoCarta 2.0 dumasar kana protéom mitokondria salaku mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis éksprési gén diferensial anu dilakukeun dina minggu ka-8 nunjukkeun yén ngan ukur 10,5% tina sadaya protéin anu ngagaduhan parobihan anu signifikan (Gambar 1F sareng Gambar S1F), anu 195 protéin dikirangan sareng 120 protéin dikirangan (Gambar 1F). Perlu dicatet yén "analisis jalur inovatif" tina set data ieu nunjukkeun yén gén anu diékspresikeun sacara béda utamina kagolong kana set jalur métabolik spésifik anu diwatesan (Gambar 1G). Anu pikaresepeun, sanaos turunna jalur anu aya hubunganana sareng OXPHOS sareng sinyal kalsium mastikeun induksi disfungsi mitokondria dina PN anu kakurangan fusi, kategori sanés anu utamina ngalibatkeun métabolisme asam amino ningkat sacara signifikan, anu saluyu sareng métabolisme anu lumangsung dina PN mitokondria. Rewiring konsisten.
(A) Poto confocal répréséntatif tina bagian cerebellar tina beurit CTRL sareng Mfn2cKO anu nunjukkeun leungitna progresif PN (calbindin, kulawu); inti diwarnaan ku DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varian hiji arah, ***P<0,001; n = 4 dugi ka 6 bunderan ti tilu beurit). (C) Alur kerja ékspériméntal. (D) Distribusi peta panas tina spidol khusus pikeun Purkinje (luhur) sareng jinis sél sanésna (tengah). (E) Diagram Venn anu nunjukkeun jumlah protéin mitokondria anu diidentipikasi dina PN anu diklasifikasikeun. (F) Plot gunungapi protéin anu diekspresikeun sacara béda dina neuron Mfn2cKO dina 8 minggu (nilai cut-off signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas nunjukkeun lima jalur up-regulation (beureum) sareng down-regulation (biru) anu paling penting dina PN Mfn2cKO anu diklasifikasikeun salaku 8 minggu. Tingkat éksprési rata-rata unggal protéin anu dideteksi dipidangkeun. Peta panas grayscale: nilai P anu disaluyukeun. ns, teu penting.
Data protéomik nunjukkeun yén éksprési protéin tina kompleks I, III, sareng IV laun-laun turun. Kompleks I, III, sareng IV sadayana ngandung subunit anu dikodekeun ku mtDNA anu penting, sedengkeun kompleks II, anu ngan ukur dikodekeun ku nuklir, dasarna teu kapangaruhan (Gambar 2A sareng Gambar S2A). . Saluyu sareng hasil protéomik, imunohistokimia tina bagian jaringan serebelum nunjukkeun yén tingkat subunit MTCO1 (subunit oksidase sitokrom C mitokondria 1) tina kompleks IV dina PN laun-laun turun (Gambar 2B). Subunit anu dikodekeun ku mtDNA Mtatp8 turun sacara signifikan (Gambar S2A), sedengkeun tingkat ajeg tina subunit sintase ATP anu dikodekeun ku nuklir tetep teu robih, anu saluyu sareng kompleks F1 subassembly ATP sintase stabil anu dipikanyaho nalika éksprési mtDNA stabil. Formasina konsisten. Interrupt (7). Evaluasi tingkat mtDNA dina Mfn2cKO PN anu diurutkeun ku réaksi ranté polimérase waktos nyata (qPCR) mastikeun panurunan laun dina jumlah salinan mtDNA. Dibandingkeun sareng kelompok kontrol, dina umur 8 minggu, ngan sakitar 20% tina tingkat mtDNA anu ditahan (Gambar 2C). Saluyu sareng hasil ieu, pewarnaan mikroskop confocal tina Mfn2cKO PN dianggo pikeun ngadeteksi DNA, nunjukkeun konsumsi nukléotida mitokondria anu gumantung kana waktos (Gambar 2D). Kami mendakan yén ngan ukur sababaraha calon anu kalibet dina degradasi protéin mitokondria sareng réspon setrés anu diatur, kalebet Lonp1, Afg3l2 sareng Clpx, sareng faktor perakitan kompleks OXPHOS. Teu aya parobahan anu signifikan dina tingkat protéin anu kalibet dina apoptosis anu dideteksi (Gambar S2B). Nya kitu, kami mendakan yén mitokondria sareng saluran retikulum endoplasma anu kalibet dina transportasi kalsium ngan ukur gaduh parobahan minor (Gambar S2C). Salian ti éta, évaluasi protéin anu aya hubunganana sareng autofagi henteu mendakan parobahan anu signifikan, anu saluyu sareng induksi autofagosom anu katingali anu dititénan in vivo ku imunohistokimia sareng mikroskop éléktron (Gambar S3). Nanging, disfungsi OXPHOS progresif dina PN dibarengan ku parobahan mitokondria ultrastruktural anu jelas. Gugus mitokondria tiasa katingali dina awak sél sareng tangkal dendritik PN Mfn2cKO umur 5 sareng 8 minggu, sareng struktur mémbran jero parantos ngalaman parobahan anu ageung (Gambar S4, A sareng B). Saluyu sareng parobahan ultrastruktural ieu sareng panurunan anu signifikan dina mtDNA, analisis irisan cerebellar serebral akut nganggo tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) nunjukkeun yén poténsi mémbran mitokondria dina PN Mfn2cKO turun sacara signifikan (Gambar S4C).
(A) Analisis jangka waktu tina tingkat éksprési kompléks OXPHOS. Ngan ukur mertimbangkeun protéin kalayan P<0,05 dina 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis putus-putus: Teu aya panyesuaian dibandingkeun sareng CTRL. (B) Kénca: Conto bagian cerebellar anu dilabélan ku antibodi anti-MTCO1 (bar skala, 20 μm). Daérah anu ditempatan ku awak sél Purkinje ditutupan ku konéng. Katuhu: Kuantifikasi tingkat MTCO1 (analisis varian hiji arah; n = 7 dugi ka 20 sél anu dianalisis tina tilu beurit). (C) Analisis qPCR tina jumlah salinan mtDNA dina PN anu diurutkeun (analisis varian hiji arah; n = 3 dugi ka 7 beurit). (D) Kénca: Conto irisan cerebellar anu dilabélan ku antibodi anti-DNA (bar skala, 20 μm). Daérah anu ditempatan ku awak sél Purkinje ditutupan ku konéng. Katuhu: Kuantifikasi lési mtDNA (analisis varian hiji arah; n = 5 dugi ka 9 sél tina tilu beurit). (E) Conto bagian cerebellar akut anu nunjukkeun sél mitoYFP + Purkinje (panah) dina rékaman patch clamp sél sakabéhna. (F) Kuantifikasi kurva IV. (G) Rékaman répréséntatif tina suntikan arus depolarisasi dina sél CTRL sareng Mfn2cKO Purkinje. Lacak luhur: Pulsa munggaran anu micu AP. Lacak handap: Frékuénsi AP maksimum. (H) Kuantifikasi input spontan postsinaptik (sPSP). Lacak rékaman répréséntatif sareng rasio zumna dipidangkeun dina (I). Analisis varian hiji arah dianalisis n = 5 dugi ka 20 sél tina tilu beurit. Data dikedalkeun salaku rata-rata ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Lacak répréséntatif tina AP spontan anu dirékam nganggo modeu patch clamp perforasi. Lacak luhur: Frékuénsi AP maksimum. Lacak handap: zum tina hiji AP. (K) Kuantifikasi frékuénsi AP rata-rata sareng maksimum numutkeun (J). Tés Mann-Whitney; n = 5 sél dianalisis tina opat beurit. Data dikedalkeun salaku rata-rata ± SEM; teu penting.
Karusakan OXPHOS anu jelas katingali dina PN Mfn2cKO anu umurna 8 minggu, nunjukkeun yén fungsi fisiologis neuron teu normal pisan. Ku alatan éta, urang nganalisis karakteristik listrik pasif neuron anu kakurangan OXPHOS dina 4 dugi ka 5 minggu sareng 7 dugi ka 8 minggu ku cara ngalakukeun rékaman patch clamp sél lengkep dina irisan cerebellar akut (Gambar 2E). Teu disangka-sangka, rata-rata poténsi mémbran istirahat sareng résistansi input neuron Mfn2cKO sami sareng kontrol, sanaos aya béda anu halus antara sél (Tabel 1). Nya kitu, dina umur 4 dugi ka 5 minggu, teu aya parobahan anu signifikan dina hubungan arus-tegangan (kurva IV) anu kapendak (Gambar 2F). Nanging, teu aya neuron Mfn2cKO anu umurna 7 dugi ka 8 minggu anu salamet tina regimen IV (léngkah hiperpolarisasi), nunjukkeun yén aya sensitivitas anu jelas kana poténsi hiperpolarisasi dina tahap akhir ieu. Sabalikna, dina neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi anu nyababkeun pelepasan poténsial aksi (AP) anu diulang-ulang ditolerir kalayan saé, nunjukkeun yén pola pelepasan sacara umum henteu béda sacara signifikan ti neuron kontrol umur 8 minggu (Tabel 1 sareng Gambar 2G). Nya kitu, frékuénsi sareng amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSC) sami sareng anu aya dina grup kontrol, sareng frékuénsi kajadian ningkat ti 4 minggu ka 5 minggu ka 7 minggu ka 8 minggu kalayan paningkatan anu sami (Gambar 2, H sareng I). Periode pematangan sinaptik dina PN (25). Hasil anu sami diala saatos tambalan PN anu dilubangi. Konfigurasi ieu nyegah kamungkinan kompensasi cacad ATP sélular, sapertos anu tiasa kajantenan dina rékaman clamp patch sél sadayana. Khususna, poténsial mémbran istirahat sareng frékuénsi némbak spontan neuron Mfn2cKO henteu kapangaruhan (Gambar 2, J sareng K). Singkatna, hasil ieu nunjukkeun yén PN kalayan disfungsi OXPHOS anu jelas tiasa ngatasi pola debit frékuénsi luhur kalayan saé, nunjukkeun yén aya mékanisme kompensasi anu ngamungkinkeun aranjeunna pikeun ngajaga réspon éléktrofisiologis anu ampir normal.
Data dikedalkeun salaku rata-rata ± SEM (analisis varian hiji arah, uji babandingan berganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomer unit dituduhkeun ku kurung.
Kami ngamimitian nalungtik naha aya kategori dina sét data protéomik (Gambar 1G) anu ngawengku jalur anu tiasa ngalawan kakurangan OXPHOS anu parah, ku kituna ngajelaskeun kunaon PN anu kapangaruhan tiasa ngajaga éléktrofisiologi anu ampir normal (Gambar 2, E dugi ka K). Analisis protéomik nunjukkeun yén énzim anu kalibet dina katabolisme asam amino ranté cabang (BCAA) ningkat sacara signifikan (Gambar 3A sareng Gambar S5A), sareng produk ahir asetil-CoA (CoA) atanapi suksinil CoA tiasa nambihan trikarboksilat dina siklus Asam arteriosklerosis (TCA). Kami mendakan yén eusi BCAA transaminase 1 (BCAT1) sareng BCAT2 duanana ningkat. Éta ngatalisis léngkah munggaran katabolisme BCAA ku cara ngahasilkeun glutamat tina α-ketoglutarat (26). Sadaya subunit anu ngawangun kompleks dehidrogenase asam keto ranté cabang (BCKD) di-upregulasi (kompleks ieu ngatalisis dekarboksilasi salajengna sareng teu tiasa dibalikkeun tina rorongkong karbon BCAA anu dihasilkeun) (Gambar 3A sareng Gambar S5A). Nanging, teu aya parobihan anu jelas dina BCAA sorangan anu kapendak dina PN anu diurutkeun, anu tiasa disababkeun ku paningkatan serapan sélular asam amino ésénsial ieu atanapi panggunaan sumber sanés (glukosa atanapi asam laktat) pikeun ngalengkepan siklus TCA (Gambar S5B). PN anu kakurangan OXPHOS ogé nunjukkeun paningkatan kagiatan dekomposisi glutamin sareng transaminasi dina umur 8 minggu, anu tiasa dibayangkeun ku paningkatan régulasi énzim mitokondria glutaminase (GLS) sareng glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A sareng C). Perlu dicatet yén paningkatan GLS diwatesan ku isoform glutaminase C anu disambung (GLS-GAC) (parobahan Mfn2cKO/CTRL sakitar 4,5 kali lipat, P = 0,05), sareng paningkatan spésifikna dina jaringan kanker tiasa ngadukung bioénergi mitokondria. (27).
(A) Peta panas nunjukkeun parobahan lipatan dina tingkat protéin pikeun rute anu ditangtukeun dina 8 minggu. (B) Conto irisan cerebellar anu dilabélan ku antibodi anti-PCx (bar skala, 20 μm). Panah konéng nunjuk ka awak sél Purkinje. (C) Analisis éksprési protéin kursus waktos anu diidentifikasi salaku calon penting pikeun aterosklerosis (uji-t sababaraha, *FDR <5%; n = 3-5 beurit). (D) Di luhur: Diagram skematis anu nunjukkeun cara anu béda pikeun ngalebetkeun karbon anu dilabélan anu aya dina panyusur [1-13C]piruvat (nyaéta, via PDH atanapi rute trans-arteri). Handap: Bagan biola nunjukkeun perséntase karbon anu dilabélan tunggal (M1) anu dirobih janten asam aspartat, asam sitrat sareng asam malat saatos ngalabel irisan cerebellar akut ku [1-13C]piruvat (uji-t dipasangkeun; ** P <0,01). (E) Analisis riwayat waktos anu komprehensif tina jalur anu dituduhkeun. Ngan pertimbangkeun protéin kalayan P<0,05 dina 8 minggu​​. Garis putus-putus: teu aya nilai pangaluyuan (analisis varian dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data dikedalkeun salaku rata-rata ± SEM.
Dina analisis kami, katabolisme BCAA parantos janten salah sahiji jalur up-regulation konci. Kanyataan ieu nunjukkeun pisan yén volume ventilasi anu lebet kana siklus TCA tiasa robih dina PN anu kakurangan OXPHOS. Ieu tiasa ngawakilan bentuk utama tina rewiring métabolik neuronal, anu tiasa gaduh dampak langsung kana fisiologi neuronal sareng survival salami pangropéa disfungsi OXPHOS anu parah. Saluyu sareng hipotesis ieu, kami mendakan yén énzim anti-aterosklerotik utama PCx diatur up (Mfn2cKO/CTRL robih sakitar 1,5 kali; Gambar 3A), anu ngatalisis konvérsi piruvat janten oksaloasetat (28), anu dipercaya aya dina jaringan otak. Éksprési dina diwatesan pikeun astrosit (29, 30). Saluyu sareng hasil protéomik, mikroskop confocal nunjukkeun yén éksprési PCx ningkat sacara khusus sareng sacara signifikan dina PN anu kakurangan OXPHOS, sedengkeun réaktivitas PCx utamina diwatesan kana sél glial Bergmann anu caket tina kontrol (Gambar 3B). Pikeun nguji sacara fungsional upregulasi PCx anu dititénan, kami ngubaran irisan cerebellar akut nganggo pelacak [1-13C]piruvat. Nalika piruvat dioksidasi ku piruvat dehidrogenase (PDH), labél isotopna ngaleungit, Tapi dilebetkeun kana zat antara siklus TCA nalika piruvat dimetabolisme ku réaksi vaskular (Gambar 3D). Pikeun ngadukung data protéomik kami, kami niténan sajumlah ageung spidol tina pelacak ieu dina asam aspartat tina irisan Mfn2cKO, sedengkeun asam sitrat sareng asam malat ogé gaduh tren sedeng, sanaos henteu signifikan (Gambar 3D).
Dina neuron dopamin beurit MitoPark anu disfungsi mitokondria disababkeun ku neuron dopamin anu khusus ngancurkeun gén faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), éksprési PCx ogé ningkat sacara signifikan (31), nunjukkeun yén arteriosklerosis asam aseton. Kajadian panyakit ieu diatur nalika disfungsi OXPHOS neuronal dina awak. Perlu dicatet yén parantos kapendak yén énzim unik (32-34) anu tiasa diekspresikeun dina neuron anu tiasa aya hubunganana sareng arteriosklerosis ningkat sacara signifikan dina PN anu kakurangan OXPHOS, sapertos propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonyl-CoA ngarobih propionil-CoA janten suksinil-CoA sareng énzim malat mitokondria 3 (ME3), anu peran utama na nyaéta pikeun mulangkeun piruvat tina malat (Gambar 3, A sareng C) (33, 35). Salian ti éta, urang mendakan paningkatan anu signifikan dina énzim Pdk3, anu ngafosforilasi sahingga nganonaktipkeun PDH (36), sedengkeun teu aya parobahan anu dideteksi dina énzim Pdp1 anu ngaktifkeun PDH atanapi kompleks énzim PDH sorangan (Gambar 3A). Sacara konsisten, dina Mern2cKO PN, fosforilasi subunit α1 α (PDHE1α) subunit tina komponén piruvat dehidrogenase E1 tina kompleks PDH dina Ser293 (anu dipikanyaho ngahambat aktivitas énzim PDH) ningkat (Gambar S6C) (Gambar S6C). Piruvat teu gaduh aksés vaskular.
Pamungkas, urang mendakan yén jalur super biosintésis serin sareng glisin, siklus folat mitokondria (1C) anu aya hubunganana sareng biosintésis prolin (Gambar 1G sareng Gambar S5C) sadayana ningkat sacara signifikan, numutkeun laporan, salami prosés aktivasi. Jaringan di sakurilingna diaktipkeun ku disfungsi mitokondria (5-7). Analisis confocal anu ngadukung data protéomik ieu nunjukkeun yén dina PN kalayan OXPHOS anu leungit, irisan cerebellar beurit umur 8 minggu dibéré serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), énzim konci siklus folat mitokondria. Réspon imun anu signifikan (Gambar S5D). Dina 13 irisan cerebellar akut anu diinkubasi ku CU-glukosa, ékspérimén pelacakan métabolik langkung mastikeun paningkatan biosintésis serin sareng prolin, nunjukkeun yén fluks isoform karbon kana serin sareng prolin ningkat (Gambar S5E). Kusabab réaksi anu dipromosikeun ku GLS sareng GPT2 tanggung jawab kana sintésis glutamat tina glutamin sareng transaminasi antara glutamat sareng α-ketoglutarat, upregulasi na nunjukkeun yén neuron anu kakurangan OXPHOS ngagaduhan paningkatan paménta pikeun glutamat, Ieu tiasa ditujukeun pikeun ngajaga paningkatan biosintésis prolin (Gambar S5C). Sabalikna tina parobihan ieu, analisis protéomik astrosit cerebellar tina beurit Mfn2cKO spésifik PN nunjukkeun yén jalur ieu (kalebet sadaya antiperoksidase) henteu robih sacara signifikan dina éksprési, ku kituna nunjukkeun yén pangalihan métabolik ieu selektif pikeun PN anu didegradasi (Gambar S6, D dugi ka G).
Singkatna, analisis ieu ngungkabkeun pola aktivasi temporal jalur métabolik spésifik anu béda sacara signifikan dina PN. Sanaos fungsi mitokondria neuronal anu abnormal tiasa nyababkeun aterosklerosis awal sareng remodeling 1C (Gambar 3E sareng Gambar S5C), sareng bahkan parobahan anu tiasa diprediksi dina éksprési kompleks I sareng IV, parobahan dina sintésis serin de novo ngan ukur katingali dina tahap akhir. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E sareng Gambar S5C). Panemuan ieu ngajelaskeun prosés sekuensial dimana mitokondria (siklus 1C) sareng sitoplasma (biosintésis serin) anu diinduksi setrés ngaréspon sacara sinergis sareng paningkatan aterosklerosis dina siklus TCA pikeun ngabentuk deui métabolisme neuronal.
PN umur 8 minggu anu kakurangan OXPHOS tiasa ngajaga aktivitas eksitasi frékuénsi luhur sareng ngalaman rékonéksi métabolik anu signifikan pikeun ngimbangan disfungsi mitokondria. Panemuan ieu ngangkat kamungkinan anu pikaresepeun yén bahkan dina waktos ayeuna, sél-sél ieu ogé tiasa nampi intervensi terapi pikeun ngalambatkeun atanapi nyegah neurodegenerasi. Telat. Kami ngabéréskeun kamungkinan ieu ngalangkungan dua intervensi mandiri. Dina metode anu munggaran, kami ngarancang vektor virus anu pakait sareng adeno (AAV) anu gumantung kana Cre supados MFN2 tiasa diekspresikan sacara selektif dina PN anu kakurangan OXPHOS in vivo (Gambar S7A). AAV anu ngodekeun MFN2 sareng gén reporter fluoresensi mCherry (Mfn2-AAV) diverifikasi dina kultur neuron primér in vitro, anu nyababkeun MFN2 diekspresikan dina cara anu gumantung kana Cre sareng nyalametkeun morfologi mitokondria, sahingga nyegah neuromutasi dina neuron Mfn2cKO (Gambar S7, B, D sareng E). Salajengna, urang ngalaksanakeun ékspérimén in vivo pikeun sacara stereotaktis nganteurkeun Mfn2-AAV umur 8 minggu ka korteks cerebellar beurit Mfn2cKO sareng beurit kontrol, sareng nganalisis beurit umur 12 minggu (Gambar 4A). Beurit Mfn2cKO anu dirawat maot (Gambar 1, A sareng B) (16). Transduksi virus in vivo ngahasilkeun éksprési selektif PN dina sababaraha bunderan cerebellar (Gambar S7, G sareng H). Suntikan AAV kontrol anu ngan ukur ngébréhkeun mCherry (Ctrl-AAV) teu gaduh pangaruh anu signifikan kana tingkat neurodegenerasi dina sato Mfn2cKO. Sabalikna, analisis Mfn2cKO anu ditransduksi ku Mfn2-AAV nunjukkeun pangaruh pelindung anu signifikan tina lapisan sél PN (Gambar 4, B sareng C). Khususna, kapadetan neuron sigana ampir teu tiasa dibédakeun tina sato kontrol (Gambar 4, B sareng C, sareng Gambar S7, H sareng I). Éksprési MFN1 tapi sanés MFN2 sami efektifna dina nyalametkeun maotna neuronal (Gambar 4C sareng Gambar S7, C sareng F), anu nunjukkeun yén éksprési MFN1 ektopik tiasa sacara efektif ngalengkepan kakurangan MFN2. Analisis salajengna dina tingkat PN tunggal nunjukkeun yén Mfn2-AAV sacara ageung nyalametkeun ultrastruktur mitokondria, normalisasi tingkat mtDNA, sareng malikkeun éksprési anu luhur tina pananda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C dugi ka E). Inspeksi visual beurit Mfn2cKO anu disalametkeun dina kaayaan istirahat nunjukkeun yén postur sareng gejala motorikna (gerakan S1 dugi ka S3) ningkat. Dina kacindekanana, ékspérimén ieu nunjukkeun yén reintroduksi MFN2 anu ditunda kana PN anu kakurangan OXPHOS cekap pikeun malikkeun konsumsi mtDNA sareng nimbulkeun aterosklerosis, sahingga nyegah degenerasi akson sareng maotna neuronal in vivo.
(A) Skéma anu nunjukkeun jadwal ékspérimén pikeun nyuntikkeun AAV anu ngodekeun MFN2 nalika jalur métabolik anu dituduhkeun diaktipkeun. (B) Gambar confocal répréséntatif tina irisan cerebellar umur 12 minggu anu ditransduksi dina 8 minggu dina beurit Mfn2cKO sareng dilabélan ku antibodi anti-Calbindin. Katuhu: Skala serat akson. Skala zum akson nyaéta 450 sareng 75 μm. (C) Kénca: Kuantifikasi kapadetan sél Purkinje dina loop transduksi AAV (AAV+) (analisis varian hiji arah; n = 3 beurit). Katuhu: analisis fokus mtDNA dina PN anu ditransduksi dina minggu ka-12 (uji-t anu teu dipasangkeun; n = 6 sél tina tilu beurit). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mikrograf éléktron transmisi répréséntatif tina PN tina bagian cerebellar Mfn2cKO anu ditransduksi sareng véktor virus anu dituduhkeun. Topéng pink ngagambarkeun daérah anu ditempatan ku dendrit, sareng kotak titik-titik konéng ngagambarkeun zum anu disayogikeun di katuhu; n ngagambarkeun inti. Bilah skala, 1μm. (E) nunjukkeun conto pewarnaan PCx dina PN anu ditransduksi dina 12 minggu. Bilah skala, 20μm. OE, overekspresi; FC, parobahan lipatan.
Pamungkas, urang nalungtik pentingna salametna sél anu diinduksi ku peroksidase dina PN anu ngalaman disfungsi OXPHOS. Urang ngahasilkeun mCherry anu ngodekeun AAV-shRNA (RNA jepit rambut pondok) khusus narékahan mRNA PCx beurit (AAV-shPCx), sareng nyuntikkeun virus atanapi kontrol acakna (AAV-scr) kana cerebellum beurit Mfn2cKO. Suntikan dilakukeun dina minggu kaopat umur (Gambar 5A) pikeun ngahontal knockdown PCx anu efektif salami période nalika éksprési PCx ningkat (Gambar 3C) sareng lapisan sél PN masih utuh (Gambar 1A). Perlu dicatet yén knockdown PCx (Gambar S8A) nyababkeun akselerasi anu signifikan tina maot PN, anu diwatesan ku cincin anu kainféksi (Gambar 5, B sareng C). Pikeun ngartos mékanisme épék métabolik anu diinduksi ku up-regulation PCx, urang nalungtik status rédoks PN saatos PCx knockdown sareng biosensor optik anu dimediasi AAV Grx1-roGFP2 diekspresikan sacara simultan (Gambar S8, B dugi ka D) pikeun meunteun glutation Parobahan relatif poténsial rédoks péptida (38). Teras, urang ngalaksanakeun mikroskop pencitraan fluoresensi dua-foton salami hirup (FLIM) dina irisan otak akut Mfn2cKO umur 7 minggu atanapi sasama kontrol pikeun ngadeteksi parobahan poténsial dina status rédoks sitoplasmik saatos mastikeun kaayaan FLIM (Gambar S8, E dugi ka G). Analisis nunjukkeun paningkatan anu signifikan dina kaayaan oksidasi hiji PN Mfn2cKO anu kakurangan éksprési PCx, anu béda ti neuron kontrol atanapi PN Mfn2cKO anu ngan ukur ngébréhkeun shRNA acak (Gambar 5, D sareng E). Nalika éksprési PCx dikirangan, perséntase Mfn2cKO PN anu nunjukkeun kaayaan teroksidasi anu luhur ningkat langkung ti tilu kali lipat (Gambar 5E), nunjukkeun yén paningkatan PCx ngajaga kapasitas rédoks neuron anu rusak.
(A) Skéma anu nunjukkeun jadwal ékspérimén pikeun nyuntikkeun AAV anu ngodekeun shPCx nalika jalur métabolik anu dituduhkeun diaktipkeun. (B) Poto confocal répréséntatif tina bagian cerebellar umur 8 minggu dina beurit Mfn2cKO anu ditransduksi sareng dilabélan ku antibodi anti-calcineurin dina 4 minggu. Bilah skala, 450μm. (C) Kuantifikasi kapadetan sél Purkinje dina loop anu ditransduksi AAV (analisis varian hiji arah; n = 3 dugi ka 4 beurit). Data dikedalkeun salaku rata-rata ± SEM; ***P <0,001. (D) Gambar FLIM répréséntatif nunjukkeun umur rata-rata PN umur 7 minggu anu ngébréhkeun sénsor glutathione redox Grx1-roGFP2 dina kaayaan ékspérimén anu ditangtukeun. Babandingan LUT (tabel pamilarian): interval waktos salamet (dina pikodetik). Bilah skala, 25μm. (E) Histogram nunjukkeun distribusi nilai umur Grx1-roGFP2 ti (D) (n=158 nepi ka 368 sél dina dua beurit dina unggal kaayaan). Bagan pai di luhur unggal histogram: nunjukkeun jumlah sél kalayan nilai umur anu langkung panjang (beureum, teroksidasi) atanapi langkung pondok (biru, dikirangan) sacara signifikan, anu ngaleuwihan 1 SD tina nilai umur rata-rata dina CTRL-AAV-scr. (F) Modél anu diusulkeun nunjukkeun pangaruh pelindung tina upregulasi PCx neuronal.
Sacara umum, data anu kami pasihan di dieu nunjukkeun yén éksprési ulang MFN2 tiasa nyalametkeun PN tingkat lanjut kalayan kakurangan OXPHOS anu parah, panurunan mtDNA anu parah, sareng morfologi sapertos ista anu teu normal pisan, ku kituna nyayogikeun kamajuan anu terus-terusan bahkan dina panyakit tingkat lanjut. Neurodegenerasi nyayogikeun bukti anu tiasa dibalikkeun tina tahapan sateuacan maot sél. Tingkat kalenturan métabolik ieu langkung ditekenkeun ku kamampuan neuron pikeun ngainduksi aterosklerosis (ngawangun deui siklus TCA), anu ngahalangan éksprési PCx dina PN anu kakurangan OXPHOS sareng ningkatkeun maot sél, ku kituna maénkeun peran pelindung (Gambar 5F).
Dina ieu panilitian, kami nyayogikeun bukti yén réspon PN kana disfungsi OXPHOS laun-laun konvergen kana aterosklerosis siklus TCA ngaliwatan jalur aktivasi diferensial anu diaktipkeun ku program métabolik. Kami mastikeun analisis protéomik kalayan seueur metode pelengkap sareng ngungkabkeun yén nalika ditantang ku disfungsi mitokondria anu parah, neuron gaduh bentuk élastisitas métabolik anu sateuacanna teu dipikanyaho. Anu matak héran, sadaya prosés rewiring henteu merta nandakeun kaayaan métabolik terminal anu ngiringan neurodegenerasi laun-laun sareng teu tiasa dibalikkeun deui, tapi data kami nunjukkeun yén éta tiasa janten neuron pangropéa bahkan dina tahap sateuacan maot sél Mékanisme kompensasi fungsional. Panemuan ieu nunjukkeun yén neuron gaduh tingkat plastisitas métabolik anu lumayan dina awak. Kanyataan ieu ngabuktikeun yén reintroduksi MFN2 engké tiasa ngabalikeun éksprési spidol métabolik konci sareng nyegah degenerasi PN. Sabalikna, éta ngahambat aterosklerosis sareng ngagancangkeun saraf. transeksual.
Salah sahiji panemuan anu paling pikaresepeun dina panilitian kami nyaéta PN anu kakurangan OXPHOS tiasa ngarobih métabolisme siklus TCA ku cara ningkatkeun énzim anu khusus ngarangsang arteriosklerosis. Susunan ulang métabolik mangrupikeun ciri umum sél kanker, sababaraha di antarana ngandelkeun glutamin pikeun nambihan zat antara siklus TCA pikeun ngahasilkeun ékuivalén pangurangan, anu ngadorong ranté pernapasan sareng ngajaga produksi prékursor biosintésis lipid sareng nukléotida (39, 40). Panilitian anyar nunjukkeun yén dina jaringan periferal anu ngalaman disfungsi OXPHOS, panyambungan deui métabolisme glutamin/glutamat ogé mangrupikeun ciri anu nonjol (5, 41), dimana arah asupna glutamin kana siklus TCA gumantung kana Kusabab parahna tatu OXPHOS (41). ). Nanging, kurangna bukti anu jelas ngeunaan kamiripan plastisitas métabolik neuronal dina awak sareng kamungkinan relevansina dina kontéks panyakit. Dina panilitian in vitro anyar, neuron kortikal primér dipidangkeun pikeun ngamobilisasi kolam glutamat pikeun neurotransmisi, sahingga ngamajukeun métabolisme oksidatif sareng aterosklerosis dina kaayaan setrés métabolik (42). Perlu dicatet yén dina inhibisi farmakologis énzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat dipercaya ngajaga sintésis oksaloasetat dina neuron granul serebelar anu dibudidayakeun (34). Nanging, relevansi fisiologis mékanisme ieu pikeun jaringan otak (dimana aterosklerosis dipercaya utamina diwatesan ku astrosit) masih gaduh signifikansi fisiologis anu penting (43). Dina hal ieu, data kami nunjukkeun yén PN anu ruksak ku OXPHOS dina awak tiasa dialihkeun kana degradasi BCAA sareng karboksilasi piruvat, anu mangrupikeun dua sumber utama suplementasi antara kolam renang TCA. Sanaos kontribusi putatif katabolisme BCAA kana métabolisme énergi neuronal parantos diusulkeun, salian ti peran glutamat sareng GABA pikeun neurotransmisi (44), masih teu aya bukti pikeun mékanisme ieu in vivo. Ku alatan éta, gampang pikeun berspekulasi yén PN anu disfungsional tiasa sacara otomatis ngimbangan konsumsi antara TCA anu didorong ku prosés asimilasi ku ningkatkeun aterosklerosis. Utamana, paningkatan PCx tiasa diperyogikeun pikeun ngajaga paningkatan paménta asam aspartat, anu disarankeun dina sél anu proliferasi kalayan disfungsi mitokondria (45). Nanging, analisis métabolomika kami henteu ngungkabkeun parobahan anu signifikan dina tingkat asam aspartat dina kaayaan ajeg dina Mfn2cKO PN (Gambar S6A), anu sigana ngagambarkeun panggunaan métabolik asam aspartat anu béda antara sél anu proliferasi sareng neuron pasca-mitosis. Sanaos mékanisme anu pasti tina paningkatan PCx dina neuron disfungsional in vivo masih kedah dicirikeun, kami nunjukkeun yén réspon prématur ieu maénkeun peran penting dina ngajaga kaayaan rédoks neuron, anu dipidangkeun dina ékspérimén FLIM dina irisan cerebellar. Utamana, nyegah PN tina ningkatkeun PCx tiasa nyababkeun kaayaan anu langkung teroksidasi sareng ngagancangkeun maot sél. Aktivasina degradasi BCAA sareng karboksilasi piruvat sanés cara pikeun ngacirikeun jaringan periferal disfungsi mitokondria (7). Ku alatan éta, aranjeunna sigana janten fitur prioritas neuron anu kakurangan OXPHOS, sanaos sanés hiji-hijina fitur, anu penting pikeun neurodegenerasi. .
Panyakit cerebellar mangrupikeun jinis panyakit neurodegeneratif hétérogén anu biasana némbongan salaku ataksia sareng sering ngaruksak PN (46). Populasi neuron ieu rentan pisan kana disfungsi mitokondria sabab degenerasi selektifna dina beurit cekap pikeun ngahasilkeun seueur gejala motor anu ngacirikeun ataksia spinocerebellar manusa (16, 47, 48). Numutkeun laporan, modél beurit transgenik kalayan gén mutan aya hubunganana sareng ataksia spinocerebellar manusa sareng ngagaduhan disfungsi mitokondria (49, 50), anu nekenkeun pentingna nalungtik akibat tina kakurangan OXPHOS dina PNPH. Ku alatan éta, éta cocog pisan pikeun ngasingkeun sareng nalungtik populasi neuron unik ieu sacara efektif. Nanging, kumargi PN sénsitip pisan kana tekanan sareng ngitung proporsi anu handap tina sakabéh populasi sél cerebellar, pikeun seueur panilitian dumasar omics, pamisahan selektif aranjeunna salaku sél lengkep masih mangrupikeun aspék anu nangtang. Sanaos ampir teu mungkin pikeun ngahontal kurangna kontaminasi mutlak tina jinis sél sanés (utamina jaringan déwasa), kami ngagabungkeun léngkah disosiasi anu efektif sareng FACS pikeun kéngingkeun jumlah neuron anu cekap pikeun analisis protéomik hilir, sareng gaduh cakupan protéin anu lumayan luhur (sakitar 3000 protéin) dibandingkeun sareng set data anu aya tina sakumna cerebellum (51). Ku cara ngajaga viabilitas sakabéh sél, metode anu kami sediakan di dieu ngamungkinkeun kami henteu ngan ukur pikeun mariksa parobahan dina jalur métabolik dina mitokondria, tapi ogé pikeun mariksa parobahan dina pasangan sitoplasmikna, anu ngalengkepan panggunaan tag mémbran mitokondria pikeun ngabeungharan jinis sél. Metodeu anyar pikeun jumlah mitokondria dina jaringan kompléks (52, 53). Metodeu anu kami jelaskeun henteu ngan ukur aya hubunganana sareng panilitian sél Purkinje, tapi tiasa gampang diterapkeun kana sagala jinis sél pikeun ngatasi parobahan métabolik dina otak anu gering, kalebet modél disfungsi mitokondria anu sanés.
Pamungkas, urang parantos ngaidentipikasi jandela terapi salami prosés pangaturan ulang métabolik ieu anu tiasa malikkeun tanda-tanda konci setrés sélular sareng nyegah degenerasi neuronal. Ku alatan éta, ngartos implikasi fungsional tina rewiring anu dijelaskeun di dieu tiasa masihan wawasan dasar kana pangobatan anu mungkin pikeun ngajaga viabilitas neuronal salami disfungsi mitokondria. Panalungtikan ka hareup anu ditujukeun pikeun ngabedah parobahan dina métabolisme énergi dina jinis sél otak anu sanés diperyogikeun pikeun ngungkabkeun sacara lengkep aplikasi prinsip ieu kana panyakit neurologis anu sanés.
Beurit MitoPark parantos dijelaskeun sateuacanna (31). Beurit C57BL/6N kalayan gén Mfn2 anu ngapit loxP parantos dijelaskeun sateuacanna (18) sareng disilangkan sareng beurit L7-Cre (23). Turunan heterozigot ganda anu dihasilkeun teras disilangkan sareng beurit Mfn2loxP/Mfn2loxP homozigot pikeun ngahasilkeun knockout gén spésifik Purkinje pikeun Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Dina subkumpulan kawin, alel SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) (stop-mtYFP) diwanohkeun ngalangkungan persilangan tambahan (20). Sadaya prosedur sato dilaksanakeun saluyu sareng pedoman Éropa, nasional sareng institusional sareng disatujuan ku LandesamtfürNatur ti Umwelt sareng Verbraucherschutz, Rhine-Westphalia Kalér, Jerman. Padamelan sato ogé nuturkeun pituduh ti Federasi Asosiasi Élmu Sato Laboratorium Éropa.
Saatos ngabius dislokasi serviks awéwé hamil, émbrio beurit diisolasi (E13). Korteksna dibedah dina Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) anu ditambahan ku 10 mM Hepes sareng disalurkeun kana Dulbecco's Modified Eagle's Medium anu ngandung papain (20 U/ml) sareng sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan dina DMEM) sareng disosiasikeun ku pencernaan énzimatik. Ml) dina suhu 37°C salami 20 menit, teras digiling sacara mékanis dina DMEM anu ditambahan ku 10% sérum sapi fétal. Sél-sél disiram dina kaca panutup anu dilapis ku polilisin dina kapadetan 2×106 per piring kultur 6 cm atanapi dina kapadetan 0,5×105 sél/cm2 pikeun analisis pencitraan. Saatos 4 jam, média diganti ku média bébas sérum Neurobasal anu ngandung suplemén B27 1% sareng 0,5 mM GlutaMax. Neuron-neuron teras dijaga dina suhu 37°C sareng 5% CO2 sapanjang ékspérimén, sareng dipaparinkeun saminggu sakali. Pikeun ngainduksi rekombinasi in vitro, 3μl (piring kultur 24-sumur) atanapi 0,5μl (piring 24-sumur) tina véktor virus AAV9 ieu dianggo pikeun ngubaran neuron dina dinten kadua in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nomer katalog 105530-AAV9) sareng AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nomer katalog 105545-AAV9).
DNA komplementer beurit Mfn1 sareng Mfn2 (masing-masing diala tina plasmid Addgene #23212 sareng #23213) ditandaan ku runtuyan V5 (GKPIPNPLLGLDST) di C-terminus, sareng ngahiji sareng mCherry dina pigura ngalangkungan runtuyan T2A. Grx1-roGFP2 mangrupikeun hadiah ti Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Ku ngaganti kaset tdTomato nganggo metode kloning konvensional, kaset disubklon kana tulang tonggong pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomer rujukan Addgene 28306) pikeun ngahasilkeun vektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 sareng pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Strategi anu sami dianggo pikeun ngahasilkeun véktor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pikeun ngahasilkeun konstruksi AAV-shPCx, véktor plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) diperyogikeun, anu ngandung runtuyan DNA anu ngodekeun shRNA anu narékahan beurit PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Dina kadali promotor U6, mCherry dianggo dina kadali promotor CMV. Produksi véktor AAV bantu dilaksanakeun numutkeun pitunjuk produsén (Cell Biolabs). Singkatna, anggo plasmid transfer anu ngandung mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) sacara transien Transfeksi gén pangkode 293AAV sél-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) atanapi Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), ogé pangkode protéin kapsid AAV1 sareng protéin aksésori. Plasmid plasmid kemasan, nganggo metode kalsium fosfat. Supernatan virus atah diala ku siklus beku-cair dina bak és garing/étanol sareng sél anu dilisis dina larutan saline buffer fosfat (PBS). Vektor AAV dimurnikeun ku ultrasentrifugasi gradien iodixanol anu teu kontinyu (24 jam dina 32.000 rpm sareng 4°C) sareng dikonsentrasikeun nganggo filter sentrifugal Amicon ultra-15. Titer génom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 salinan génom (GC) / ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC / ml), AAV1-CAG-FLEX sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna (54), diukur ku PCR kuantitatif waktos nyata (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC / ml) sareng AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC / ml).
Neuron primér dikerok dina 1x PBS anu tiis, di-pellet, teras dihomogenisasi dina 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolat/PBS lisis buffer anu ngandung fosfatase sareng protease inhibitor (Roche). Kuantifikasi protéin dilakukeun nganggo uji asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Protéin teras dipisahkeun ku éléktroforésis gél SDS-poliakrilamida, teras di-blot kana mémbran polivinilidena fluorida (GE Healthcare). Blokir situs anu henteu spésifik sareng inkubasi ku antibodi primér (tingali Tabel S1 kanggo langkung lengkepna) dina susu 5% dina TBST (saline buffered Tris sareng Tween), léngkah-léngkah ngumbah sareng antibodi sekundér dina TBST Inkubasi. Inkubasi ku antibodi primér sapeuting dina suhu +4°C. Saatos dikumbah, oleskeun antibodi sekundér salami 2 jam dina suhu kamar. Salajengna, ku cara inkubasi blot anu sami ku antibodi anti-β-aktin, pemuatan anu sami dikonfirmasi. Deteksi ku cara ngarobah kana kemiluminesensi sareng ningkatkeun kemiluminesensi (GE Healthcare).
Neuron anu sateuacanna di sebarkeun dina kaca panutup difiksasi ku 4% paraformaldehida (PFA)/PBS dina titik waktos anu ditangtukeun dina suhu kamar salami 10 menit. Mimitina, panutup di permeate ku 0,1% Triton X-100/PBS salami 5 menit dina suhu kamar, teras dina buffer pangblokir [3% albumin sérum sapi (BSA)/PBS]. Dina dinten kadua, panutup dikumbah ku buffer pangblokir sareng diinkubasi ku antibodi sekundér konjugasi fluorofor anu pas salami 2 jam dina suhu kamar; pamungkas, sampel di kumbah tuntas dina PBS kalayan 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) anu diwarnaan deui teras difiksasi dina slide mikroskop kalayan Aqua-Poly/Mount.
Beurit (jalu jeung bikang) dibius ku suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) jeung xylazine (10 mg/kg) tuluy dibéré sacara subkutan ku analgesik carprofen (5 mg/kg). Dilebokeun kana alat stereotaktik (Kopf) nu dilengkepan ku bantalan haneut. Buka tangkorak jeung anggo bor huntu pikeun ngipiskeun bagian korteks cerebellar nu pakait jeung tulang mis (tina lambda: buntut 1.8, lateral 1, nu pakait jeung lobulus IV jeung V). Anggo jarum suntik nu melengkung pikeun nyieun liang leutik dina tangkorak sacara saksama pikeun nyingkahan gangguan pembuluh darah di handap. Tuluy kapiler kaca ipis nu ditarik diasupkeun lalaunan kana liang mikro (ti -1.3 nepi ka -1 di sisi véntral dura mater), tuluy 200 nepi ka 300 nl AAV disuntikkeun kana mikro-injektor (Narishige) ku jarum suntik manual (Narishige) sababaraha kali dina tekanan rendah salila periode waktu 10 nepi ka 20 menit. Saatos infus, pasangkeun kapiler salami 10 menit deui supados virus nyebar sacara lengkep. Saatos kapiler dicabut, kulit dijahit sacara saksama pikeun ngaminimalkeun peradangan tatu sareng ngamungkinkeun sato pulih. Sato-sato éta dirawat ku analgesik (caspofen) salami sababaraha dinten saatos operasi, salami waktos éta kaayaan fisikna diawasi sacara saksama teras aranjeunna dieutanasia dina waktos anu ditangtukeun. Sadaya prosedur dilaksanakeun saluyu sareng pedoman Éropa, nasional sareng institusional sareng disatujuan ku LandesamtfürNatur ti Umwelt sareng Verbraucherschutz, Rhine-Westphalia Kalér, Jerman.
Sato-sato éta dibius ku ketamin (100 mg/kg) sareng xylazine (10 mg/kg), teras jantungna diperfusi ku 0,1 M PBS heula, teras ku 4% PFA dina PBS. Jaringan éta dibedah sareng difiksasi dina 4% PFA/PBS sapeuting dina suhu 4°C. Péso anu ngageter (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) dianggo pikeun nyiapkeun bagian sagital (kandelna 50 μm) tina uteuk anu difiksasi dina PBS. Kajaba upami ditangtukeun sanés, pewarnaan bagian anu ngambang bébas dilakukeun sapertos anu dijelaskeun di luhur (13) dina suhu kamar sareng diaduk. Singkatna, mimitina, irisan anu diala dipermeabilisasi ku 0,5% Triton X-100/PBS salami 15 menit dina suhu kamar; pikeun sababaraha epitop (Pcx sareng Shmt2), ku cara ngabuffer tris-EDTA dina suhu 80°C (PH 9) panaskeun irisan salami 25 menit tinimbang léngkah ieu. Salajengna, bagian-bagian éta diinkubasi ku antibodi primér (tingali Tabel S1) dina buffer pangblokir (3% BSA/PBS) dina suhu 4°C sapeuting bari diaduk. Isukna, bagian-bagian éta dikumbah ku buffer pangblokir sareng diinkubasi ku antibodi sekundér konjugasi fluorofor anu pas salami 2 jam dina suhu kamar; pamungkas, bagian-bagian éta dikumbah tuntas dina PBS, diwarnaan balik ku DAPI, teras difiksasi ku AquaPolymount dina slide mikroskop.
Mikroskop confocal scanning laser (TCS SP8-X atanapi TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) anu dilengkepan ku laser cahaya bodas sareng laser ultraviolet dioda 405 dianggo pikeun ngagambarkeun sampel. Ku cara ngarangsang fluorofor sareng ngumpulkeun sinyal nganggo Hybrid Detector (HyDs), parangkat lunak LAS-X dianggo pikeun ngumpulkeun gambar anu ditumpuk anu saluyu sareng sampling Nyquist dina modeu sekuensial: pikeun panel non-kuantitatif, éta mangrupikeun sinyal anu dinamis pisan (contona, dina sél somatik sareng dendrit) mtYFP) Anggo HyD pikeun ngadeteksi jumlah PN dina modeu BrightR). Gating ti 0,3 dugi ka 6 ns diterapkeun pikeun ngirangan latar tukang.
Pencitraan real-time tina sél anu disortir. Saatos disortir dina média Neurobasal-A anu ngandung suplemén B27 1% sareng 0,5 mM GlutaMax, sél langsung disiram dina slide kaca anu dilapis poli-l-lisin (μ-Slide8 Well, Ibidi, nomer katalog 80826), Teras dijaga dina suhu 37°C sareng 5% CO2 salami 1 jam supados sél netep. Pencitraan real-time dilakukeun dina mikroskop confocal scanning laser Leica SP8 anu dilengkepan laser bodas, HyD, lénsa objektif minyak 63×[1,4 numerical aperture (NA)] sareng tahap pemanasan.
Beurit éta gancang dibius ku karbon dioksida teras dipenggal, uteukna gancang dikaluarkeun tina tangkorakna, teras dipotong jadi bagian sagital kandelna 200μm (pikeun ékspérimén panyiri 13C) atanapi kandelna 275μm (pikeun dua ékspérimén foton) anu dieusi ku bahan-bahan ieu. És krim (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) dieusi ku zat-zat ieu: 125 mM cairan serebrospinal jieunan (ACSF) Ca2 + tiis és, jenuh karbon (95% O2 sareng 5% CO2) rendah Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukosa, 0,5 mM CaCl2 sareng 3,5 mM MgCl2 (tekanan osmotik 310 dugi ka 330 mmol). Pindahkeun irisan otak anu diala ka rohangan pra-inkubasi anu ngandung Ca2 + ACSF anu langkung luhur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 sareng 2,0 mM MgCl2) Sedeng) pH 7,4 sareng 310 dugi ka 320 mmol).
Salila prosés pencitraan, irisan-irisan éta dipindahkeun ka rohangan pencitraan khusus, sareng ékspérimén dilaksanakeun dina perfusi ACSF kontinyu dina suhu konstan 32° dugi ka 33°C. Mikroskop pamindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) anu dilengkepan lénsa obyektif Leica 25x (NA 0.95, cai), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) dianggo pikeun pencitraan irisan. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM tina Grx1-roGFP2. Parobihan dina kaayaan redoks sitoplasmik PN diukur ku FLIM dua-foton dina irisan otak sagital, dimana biosensor Grx1-roGFP2 narékahan PN. Dina lapisan PN, widang akuisisi dipilih sakitar 50 dugi ka 80 μm di handap permukaan irisan pikeun mastikeun yén aya PN anu layak (nyaéta, kurangna struktur manik-manik atanapi parobahan morfologis neuronal sapanjang dendrit) sareng sénsor roGFP2 positif ganda sareng AAV anu ngodekeun shRNA PCx atanapi runtuyan kontrolna (masing-masing ngébréhkeun mCherry). Kumpulkeun gambar tumpukan tunggal kalayan zum digital 2x [panjang gelombang éksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: grup filter HyD internal, fluorescein isothiocyanate (FITC)] sareng rata-rata gambar dina 2 dugi ka 3 menit dianggo pikeun mastikeun yén cukup foton dikumpulkeun (total 1000 foton) pikeun pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 sareng verifikasi kaayaan FLIM dilaksanakeun ku cara ngawaskeun nilai umur roGFP2 nalika nambihan 10 mM H2O2 éksogén kana perfusi ACSF (pikeun maksimalkeun oksidasi, anu ngahasilkeun paningkatan umur), teras nambihan 2 mM dithiothreitol (ngaminimalkeun tingkat réduksi, anu ngahasilkeun panurunan umur) (Gambar S8, D dugi ka G). Anggo parangkat lunak FLIMfit 5.1.1 pikeun nganalisis hasil anu diala, cocogkeun kurva buruk éksponénsial tunggal tina sakumna gambar kana IRF anu diukur (fungsi réspon instrumen), sareng χ2 sakitar 1. Pikeun ngitung umur hiji PN, topéng di sakitar awak saraf digambar sacara manual, sareng umur rata-rata dina unggal topéng dianggo pikeun kuantifikasi.
Analisis poténsial mitokondria. Saatos bagian akut diinkubasi ku 100 nM TMRM anu langsung ditambahkeun kana ACSF anu diperfusi salami 30 menit, parobahan poténsial mitokondria PN diukur ku mikroskop dua foton. Pencitraan TMRM dilakukeun ku cara ngarangsang probe dina 920 nm sareng nganggo HyD internal (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) pikeun ngumpulkeun sinyal; ku cara nganggo panjang gelombang eksitasi anu sami tapi nganggo HyD internal anu béda (FITC: 525/50) pikeun ngagambar mtYFP. Anggo plug-in Kalkulator Gambar ImageJ pikeun meunteun poténsial mitokondria dina tingkat sél tunggal. Singkatna, persamaan plug-in: signal = min (mtYFP, TMRM) dianggo pikeun ngaidentipikasi daérah mitokondria anu nunjukkeun sinyal TMRM dina Purkinje Somali dina gambar confocal tumpukan tunggal tina saluran anu saluyu. Teras area piksel dina topéng anu dihasilkeun diukur, teras dinormalisasi dina gambar ambang tunggal anu saluyu tina saluran mtYFP pikeun kéngingkeun fraksi mitokondria anu nunjukkeun poténsi mitokondria.
Gambar éta didekonvolusi nganggo parangkat lunak Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pikeun gambar ubin anu discan, montase hiji ubin didamel nganggo algoritma jahitan otomatis anu disayogikeun ku parangkat lunak LAS-X. Saatos kalibrasi gambar, anggo ImageJ sareng Adobe Photoshop pikeun ngolah gambar langkung lanjut sareng nyaluyukeun kacaangan sareng kontras sacara seragam. Anggo Adobe Illustrator pikeun persiapan grafis.
Analisis fokus mtDNA. Jumlah lési mtDNA diukur dina bagian cerebellar anu dilabélan ku antibodi ngalawan DNA ku mikroskop confocal. Unggal daérah target didamel pikeun awak sél sareng inti unggal sél, sareng daérah masing-masing diitung nganggo plug-in Multi Measure (software ImageJ). Kurangkeun daérah nuklir tina daérah awak sél pikeun kéngingkeun daérah sitoplasma. Pamungkas, plug-in Analyze Particles (software ImageJ) dianggo pikeun sacara otomatis ngitung titik DNA sitoplasma anu nunjukkeun mtDNA dina gambar ambang, sareng hasil anu diala dinormalisasi kana rata-rata PN beurit CTRL. Hasilna dikedalkeun salaku jumlah rata-rata nukléosida per sél.
Analisis éksprési protéin. Anggo plug-in Kalkulator Gambar ImageJ pikeun meunteun éksprési protéin dina PN dina tingkat sél tunggal. Singkatna, dina gambar confocal lapisan tunggal tina saluran anu saluyu, ngaliwatan persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), daérah mitokondria anu nunjukkeun imunoréaktivitas ka antibodi anu tangtu dina Purkina diidéntifikasi. Teras daérah piksel dina topéng anu dihasilkeun diukur, teras dinormalisasi dina gambar tumpukan tunggal ambang anu saluyu tina saluran mtYFP pikeun kéngingkeun fraksi mitokondria tina protéin anu ditampilkeun.
Analisis kapadetan sél Purkinje. Plugin Cell Counter tina ImageJ dianggo pikeun meunteun kapadetan Purkinje ku cara ngabagi jumlah sél Purkinje anu diitung ku panjang cingcin cerebellar anu ditempatan ku sél anu diitung.
Persiapan sareng pangumpulan sampel. Otak ti kelompok kontrol sareng beurit Mfn2cKO difiksasi dina 2% PFA/2,5% glutaraldehida dina 0,1 M buffer fosfat (PB), teras potongan koronal disiapkeun nganggo ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Katebalan 50 dugi ka 60 μm) Teras difiksasi dina buffer PB dina 1% os tetraoksida sareng 1,5% kalium ferosianida dina suhu kamar salami 1 jam. Potongan-potongan éta dikumbah tilu kali nganggo cai sulingan, teras diwarnaan ku 70% étanol anu ngandung 1% uranil asetat salami 20 menit. Potongan-potongan éta teras didehidrasi dina alkohol anu parantos digradasi sareng dilebetkeun kana résin époksi Durcupan ACM (résin casting Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, nomer katalog 14040) di antara slide kaca anu dilapis silikon, sareng pamungkas dina suhu 60°C dipolimerisasi dina oven salami 48 jam. Area korteks serebelum dipilih sareng bagian ultra-ipis 50 nm dipotong dina Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) teras dipilih dina grid celah tambaga 2 × 1 mm anu dilapis ku film polistirena. Bagian-bagian éta diwarnaan ku larutan uranil asetat 4% dina H2O salami 10 menit, dikumbah ku H2O sababaraha kali, teras ku Reynolds timbal sitrat dina H2O salami 10 menit, teras dikumbah ku H2O sababaraha kali. Mikrograf dicandak nganggo mikroskop éléktron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) nganggo kaméra digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, AS). Jerman).
Pikeun beurit anu kainféksi AAV, uteukna dipisahkeun sareng diiris janten bagian sagital kandel 1 mm, sareng cerebellum dipariksa nganggo mikroskop fluoresensi pikeun ngaidentipikasi cincin anu kainféksi AAV (nyaéta, ngébréhkeun mCherry). Ngan ékspérimén dimana injeksi AAV ngahasilkeun efisiensi transduksi anu luhur pisan tina lapisan sél Purkinje (nyaéta ampir sakabéh lapisan) dina sahenteuna dua cincin cerebellar berturut-turut anu dianggo. Loop anu ditransduksi AAV dimikrodisék pikeun pasca-fiksasi sapeuting (4% PFA sareng 2,5% glutaraldehida dina 0,1 M buffer cocoate) sareng diprosés salajengna. Pikeun embedding EPON, jaringan anu difiksasi dikumbah ku 0,1 M buffer sodium cocoate (Applichem), sareng diinkubasi ku 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) dina 0,1 M buffer sodium cocoate (Applichem) 4 Jam, teras dikumbah salami 2 jam. Balikan deui 3 kali nganggo 0,1 M buffer cocamide. Salajengna, runtuyan étanol anu naék dianggo pikeun ngainkubasi unggal larutan étanol dina suhu 4°C salami 15 menit pikeun ngadéhidrasi jaringan. Jaringan dipindahkeun kana propiléna oksida sareng diinkubasi sapeuting dina EPON (Sigma-Aldrich) dina suhu 4°C. Tempatkeun jaringan dina EPON seger dina suhu kamar salami 2 jam, teras lebetkeun dina suhu 62°C salami 72 jam. Anggo ultramikrotome (Leica Microsystems, UC6) sareng péso inten (Diatome, Biel, Swiss) pikeun motong bagian ultraipis 70 nm, teras warnaan ku uranil asetat 1,5% salami 15 menit dina suhu 37°C, teras warnaan ku larutan timbal sitrat salami 4 menit. Mikrograf éléktron dicandak nganggo mikroskop éléktron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) anu dilengkepan ku Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) sareng parangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Pikeun analisis, mikrograf éléktron diala nganggo zoom digital 5000× atanapi 10.000×.
Analisis morfologis mitokondria. Pikeun sadaya analisis, kontur mitokondria individu digariskeun sacara manual dina gambar digital nganggo parangkat lunak ImageJ. Parameter morfologis anu béda dianalisis. Kapadetan mitokondria dinyatakeun salaku persentase anu diala ku cara ngabagi total daérah mitokondria unggal sél ku daérah sitoplasma (daérah sitoplasma = daérah sél-daérah inti sél) × 100. Kabulatan mitokondria diitung nganggo rumus [4π∙(daérah/perimeter 2)]. Morfologi ista mitokondria dianalisis sareng dibagi kana dua kategori ("tubular" sareng "blister") numutkeun bentuk utama na.
Analisis jumlah sareng kapadetan autofagosom/lisosom. Anggo parangkat lunak ImageJ pikeun sacara manual ngagambarkeun kontur unggal autofagosom/lisosom dina gambar digital. Area autofagosom/lisosom dinyatakeun salaku persentase anu diitung ku cara ngabagi total area struktur autofagosom/lisosom unggal sél ku area sitoplasma (area sitoplasma=area sél-area inti) × 100. Kapadetan autofagosom/lisosom diitung ku cara ngabagi total jumlah ku jumlah struktur autofagosom/lisosom per sél (dina istilah area sitoplasma) (area sitoplasma = area sél-area inti).
Pelabelan pikeun pamotongan akut sareng persiapan sampel. Pikeun ékspérimén anu meryogikeun pelabelan glukosa, pindahkeun irisan otak akut ka rohangan pra-inkubasi, anu ngandung karbon jenuh (95% O2 sareng 5% CO2), Ca2 + ACSF anu luhur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 sareng 2,0 mM MgCl2, disaluyukeun kana pH 7,4 sareng 310 dugi ka 320 mOsm), dimana glukosa nyaéta 13C6- Substitusi glukosa (Eurisotop, nomer katalog CLM-1396). Pikeun ékspérimén anu meryogikeun panyiri piruvat, pindahkeun irisan otak akut ka Ca2 + ACSF anu langkung luhur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 sareng Tambahkeun 2,0 mM MgCl2, saluyukeun kana pH 7,4 sareng 310 dugi ka 320 mOsm), teras tambahkeun 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nomer katalog CLM-1082). Inkubasi bagian-bagian éta salami 90 menit dina suhu 37°C. Dina ahir ékspérimén, bagian-bagian éta gancang dikumbah ku larutan cai (pH 7,4) anu ngandung 75 mM amonium karbonat, teras dihomogenisasi dina 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: cai. Saatos bagian-bagian éta diinkubasi dina és salami 30 menit, sampel-sampel éta disentrifugasi dina 21.000 g salami 10 menit dina suhu 4°C, teras supernatan anu bening dikeringkeun dina konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit garing anu dihasilkeun disimpen dina suhu -80°C dugi ka dianalisis.
Analisis kromatografi cair-spéktrométri massa tina 13 asam amino anu dilabélan C. Pikeun analisis kromatografi cair-spéktrométri massa (LC-MS), pelet metabolit disuspensikeun deui dina 75μl cai kelas LC-MS (Honeywell). Saatos sentrifugasi dina 21.000 g salami 5 menit dina suhu 4°C, 20 μl supernatan anu diklarifikasi dianggo pikeun analisis fluks asam amino, sedengkeun sésana ekstrak langsung dianggo pikeun analisis anion (tingali di handap). Analisis asam amino dilakukeun nganggo protokol derivatisasi benzoil klorida anu parantos dijelaskeun sateuacanna (55, 56). Dina léngkah munggaran, 10μl 100 mM natrium karbonat (Sigma-Aldrich) ditambahkeun kana 20μl ekstrak metabolit, teras 10μl 2% benzoil klorida (Sigma-Aldrich) ditambahkeun kana ACN kelas LC. Sampel divorteks sakeudeung teras disentrifugasi dina 21.000 g salami 5 menit dina suhu 20°C. Pindahkeun supernatan anu parantos diberesihan kana botol autosampler 2 ml kalayan sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel dianalisis nganggo sistem LC kinerja ultra-luhur Acquity iClass (Waters) anu disambungkeun kana spéktrométer massa presisi résolusi tinggi Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Pikeun analisis, 2μl sampel anu diderivatisasi diinjeksikeun kana kolom silika T3 kakuatan tinggi 100 × 1,0 mm (Waters) anu ngandung partikel 1,8μm. Laju aliranna nyaéta 100μl/mnt, sareng sistem buffer diwangun ku buffer A (10 mM amonium format sareng 0,15% asam format dina cai) sareng buffer B (ACN). Gradienna sapertos kieu: 0%B dina 0 menit; 0%B. 0 nepi ka 15% B dina 0 nepi ka 0,1 menit; 15 nepi ka 17% B dina 0,1 nepi ka 0,5 menit; B dina 17 nepi ka 55% dina 0,5 nepi ka 14 menit; B dina 55 nepi ka 70% dina 14 nepi ka 14,5 menit; dina 14,5 nepi ka 70 nepi ka 100% B dina 18 menit; 100% B dina 18 nepi ka 19 menit; 100 nepi ka 0% B dina 19 nepi ka 19,1 menit; 0% B dina 19,1 nepi ka 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF beroperasi dina modeu ionisasi positif kalayan rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 dugi ka 750. Résolusi anu diterapkeun nyaéta 60.000, sareng target ion kontrol gain (AGC) anu diala nyaéta 3 × 106, sareng waktos ion maksimum nyaéta 100 milidetik. Sumber ionisasi éléktrospray (ESI) anu dipanaskeun beroperasi dina tegangan semprot 3,5 kV, suhu kapiler 250 °C, aliran hawa selubung 60 AU (unit arbitrer), sareng aliran hawa tambahan 20 AU. 250 °C. Lénsa S disetel ka 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS tina asam organik anu dilabélan 13C. Endapan metabolit anu sésana (55μl) dianalisis nganggo sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) anu disambungkeun kana spéktrométer massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Singkatna, 5μl ekstrak metabolit diinjeksikeun kana kolom Dionex IonPac AS11-HC anu dilengkepan HPLC (2 mm × 250 mm, ukuran partikel 4μm, Thermo Fisher Scientific) dina modeu puteran parsial push-in kalayan rasio ngeusian 1. ) Kolom penjaga Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Suhu kolom dijaga dina 30°C, sareng autosampler disetel ka 6°C. Anggo kartrid kalium hidroksida anu disayogikeun ku cai deionisasi pikeun ngahasilkeun gradien kalium hidroksida ngalangkungan generator eluen. Pamisahan metabolit dina laju aliran 380μl/mnt, nerapkeun gradien ieu: 0 dugi ka 3 menit, 10 mM KOH; 3 dugi ka 12 menit, 10 dugi ka 50 mM KOH; 12 dugi ka 19 menit, 50 dugi ka 100 mM KOH; 19 dugi ka 21 menit, 100 mM KOH; 21 dugi ka 21,5 menit, 100 dugi ka 10 mM KOH. Kolom ieu diimbangan deui dina 10 mM KOH salami 8,5 menit.
Métabolit anu diélusi digabungkeun sareng aliran suplemén isopropanol 150μl/mnt saatos kolom teras diarahkeun ka spéktrométer massa résolusi luhur anu beroperasi dina modeu ionisasi négatip. MS ngawaskeun rentang massa ti m/z 50 dugi ka 750 kalayan résolusi 60.000. AGC disetel ka 1 × 106, sareng waktos ion maksimum dijaga dina 100 ms. Sumber ESI anu dipanaskeun dioperasikeun dina tegangan semprot 3,5 kV. Setélan sumber ion anu sanés nyaéta sapertos kieu: suhu kapiler 275 °C; aliran gas selubung, 60 AU; aliran gas bantu, 20 AU dina 300 °C, sareng setélan lénsa S ka 60 AU.
Analisis data metabolit anu dilabélan 13C. Anggo parangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific) pikeun analisis data babandingan isotop. Idéntitas unggal sanyawa diverifikasi ku sanyawa rujukan anu tiasa dipercaya sareng dianalisis sacara mandiri. Pikeun ngalaksanakeun analisis pangayaan isotop, daérah kromatogram ion anu diekstrak (XIC) tina unggal isotop 13C (Mn) diekstrak tina [M + H] +, dimana n nyaéta jumlah karbon sanyawa target, anu dianggo pikeun nganalisis asam amino atanapi [MH] + dianggo pikeun nganalisis anion. Akurasi massa XIC kirang ti lima bagian per juta, sareng akurasi RT nyaéta 0,05 menit. Analisis pangayaan dilakukeun ku cara ngitung babandingan unggal isotop anu dideteksi kana jumlah sadaya isotop sanyawa anu saluyu. Babandingan ieu dibikeun salaku nilai persentase pikeun unggal isotop, sareng hasilna dinyatakeun salaku pangayaan persén molar (MPE), sapertos anu dijelaskeun sateuacanna (42).
Pélét neuron anu beku dihomogenisasi dina metanol 80% anu tiis (v/v), divortex, teras diinkubasi dina suhu -20°C salami 30 menit. Vortex sampel deui teras aduk dina suhu +4°C salami 30 menit. Sampel disentrifugasi dina 21.000 g salami 5 menit dina suhu 4°C, teras supernatan anu dihasilkeun dikumpulkeun sareng dikeringkeun nganggo konsentrator SpeedVac dina suhu 25°C pikeun analisis salajengna. Sakumaha anu dijelaskeun di luhur, analisis LC-MS dilakukeun kana asam amino sél anu diurutkeun. Nganggo TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific), analisis data dilakukeun nganggo massa monoisotop unggal sanyawa. Normalisasi kuantil data metabolit dilakukeun nganggo pakét parangkat lunak preprocessCore (57).
Nyiapkeun irisan. Beurit gancang dibius ku karbon dioksida teras dipenggal, uteuk gancang dikaluarkeun tina tangkorak, teras péso anu dieusi és (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) dianggo pikeun motongna jadi bagian sagital 300 dugi ka 375 μm Gasifikasi karbon tiis (95% O2 sareng 5% CO2) Ca2 + ACSF handap (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 sareng 6,0 mM MgCl2 Saluyukeun kana pH 7,4 sareng 310 dugi ka 330 mOsm). Pindahkeun irisan otak anu diala ka rohangan anu ngandung Ca2 + ACSF anu langkung luhur (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 4,0 mM CaCl2 sareng mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 sareng 310 dugi ka 320 mOsm). Simpen irisan salami 20 dugi ka 30 menit supados tiasa dibalikeun deui sateuacan dirékam.
rékaman. Panggung mikroskop anu dilengkepan ku rohangan rékaman anu tetep sareng lénsa objéktif rendaman cai 20x (Scientifica) dianggo pikeun sadaya rékaman. Sél Purkinje anu diduga diidentipikasi ku (i) ukuran awak, (ii) lokasi anatomis cerebellum, sareng (iii) éksprési gén reporter mtYFP fluoresensi. Pipét patch kalayan résistansi ujung 5 dugi ka 11 megohms ditarik kaluar ku kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) sareng pipet horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Sadaya rékaman dilakukeun ku amplifier clamp patch npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Jerman), anu dikontrol ku parangkat lunak Signal (versi 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Inggris). Ékspérimén ieu dirékam dina laju sampling 12,5 kHz. Sinyalna disaring ku dua filter Bessel short-pass kalayan frékuénsi cutoff masing-masing 1,3 sareng 10 kHz. Kapasitansi mémbran sareng pipet dikompensasi ku sirkuit kompensasi nganggo amplifier. Sadaya ékspérimén dilakukeun dina kontrol kaméra Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), anu dikontrol ku parangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi sareng analisis sél lengkep rutin. Sateuacan ngarékam, eusian pipet ku larutan internal anu ngandung zat-zat ieu: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalium glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosin trifosfat (GTP) (Na) sareng 10,0 mM kreatinin fosfat disaluyukeun kana pH 7,25, sareng tekanan osmotik nyaéta 290 mOsm (sukrosa). Saatos nerapkeun gaya 0 pA pikeun megatkeun mémbran, poténsi mémbran istirahat diukur. Résistansi input diukur ku cara nerapkeun arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, sareng -10 pA. Ukur gedena réspon tegangan sareng anggo hukum Ohm pikeun ngitung résistansi input. Aktivitas spontan dirékam dina klem tegangan salami 5 menit, sareng sPSC diidéntifikasi sareng diukur dina Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, AS) nganggo skrip pangakuan semi-otomatis. Kurva IV sareng arus ajeg diukur ku cara ngajepit batré dina poténsial anu béda (dimimitian ti -110 mV) sareng ningkatkeun tegangan dina léngkah 5 mV. Produksi AP diuji ku cara nerapkeun arus depolarisasi. Jepit sél dina -70 mV bari nerapkeun pulsa arus depolarisasi. Saluyukeun ukuran léngkah unggal unit rekaman sacara misah (10 dugi ka 60 pA). Hitung frékuénsi AP maksimum ku cara ngitung sacara manual lonjakan pulsa anu nyababkeun frékuénsi AP pangluhurna. Ambang AP dianalisis ku cara ngagunakeun turunan kadua tina pulsa depolarisasi anu mimiti micu hiji atanapi langkung AP.
Konfigurasi sareng analisis patch anu dilubangi. Laksanakeun rékaman patch anu dilubangi nganggo protokol standar. Anggo pipet bébas ATP sareng GTP anu henteu ngandung bahan-bahan ieu: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA sareng 2 mM MgCl2, teras saluyukeun kana pH 7,2 (nganggo KOH). ATP sareng GTP dikaluarkeun tina larutan intraseluler pikeun nyegah permeabilitas mémbran sél anu teu dikontrol. Pipet patch dieusi ku larutan internal anu ngandung amfoterisin (sakitar 200 dugi ka 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) pikeun kéngingkeun rékaman patch anu dilubangi. Amfoterisin dilarutkeun dina dimetil sulfoksida (konsentrasi ahir: 0,1 dugi ka 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO anu dianggo teu gaduh pangaruh anu signifikan kana neuron anu ditalungtik. Salila prosés punching, résistansi saluran (Ra) terus diawasi, sareng ékspérimén dimimitian saatos amplitudo Ra sareng AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan diukur dina klem tegangan sareng/atanapi arus salami 2 dugi ka 5 menit. Analisis data dilakukeun nganggo Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) sareng GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Amérika Serikat). Pikeun ngaidentipikasi AP spontan, plug-in NeuroMatic v3.0c IgorPro dianggo. Sacara otomatis ngaidentipikasi AP nganggo ambang batas anu dipasihkeun, anu disaluyukeun sacara individual pikeun unggal rékaman. Nganggo interval spike, tangtukeun frékuénsi spike kalayan frékuénsi spike instan maksimum sareng frékuénsi spike rata-rata.
Isolasi PN. Ku cara nyaluyukeun kana protokol anu parantos diterbitkeun sateuacanna, PN dimurnikeun tina cerebellum beurit dina tahap anu ditangtukeun (58). Singkatna, cerebellum dibedah sareng dicincang dina média disosiasi anu tiis [tanpa HBSS Ca2+ sareng Mg2+, ditambahan ku 20 mM glukosa, penisilin (50 U/ml) sareng streptomisin (0,05 mg/ml)], teras dicerna média dina papain [HBSS, ditambahan ku 1-sistéin·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) sareng deoksiribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Diubaran salami 30 menit dina suhu 30°C. Mimitina kumbah jaringan dina média HBSS anu ngandung lendir endog (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) sareng DNase (0,1 mg/ml) dina suhu kamar pikeun nyegah pencernaan énzimatik, teras dina média HBSS anu ngandung 20 mM glukosa. Giling lalaunan dina HBSS, penisilin (50 U/ml), streptomisin (0,05 mg/ml) sareng DNase (0,1 mg/ml) ngaleupaskeun sél tunggal. Suspénsi sél anu dihasilkeun disaring ngaliwatan saringan sél 70μm, teras sél-sélna dipél ku cara sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) sareng disuspensikeun deui dina média sortir [HBSS, ditambahan ku 20 mM glukosa, 20% fétal sapi) Sérum, penisilin (50 U/ml) sareng streptomisin (0,05 mg/ml)]; évaluasi viabilitas sél nganggo propidium iodida sareng saluyukeun kapadetan sél ka 1×106 dugi ka 2×106 sél/ml. Sateuacan sitometri aliran, suspensi disaring ngaliwatan saringan sél 50 μm.
Sitométer aliran. Pamilahan sél dilaksanakeun dina suhu 4°C nganggo mesin FACSAria III (BD Biosciences) sareng parangkat lunak FACSDiva (BD Biosciences, vérsi 8.0.1). Suspénsi sél diurutkeun nganggo nozzle 100 μm dina tekanan 20 psi dina laju ~2800 kajadian/detik. Kusabab kriteria gating tradisional (ukuran sél, diskriminasi bimodal, sareng karakteristik panyebaran) henteu tiasa mastikeun isolasi PN anu leres tina jinis sél sanés, strategi gating diatur dumasar kana babandingan langsung inténsitas YFP sareng autofluoresensi dina mitoYFP+ ​​​​sareng beurit kontrol mitoYFP −. YFP dieksitasi ku cara nyinari sampel nganggo garis laser 488 nm, sareng sinyalna dideteksi nganggo filter band pass 530/30 nm. Dina beurit mitoYFP+, kakuatan relatif gén reporter Rosa26-mitoYFP ogé dianggo pikeun ngabédakeun fragmen awak neuronal sareng akson. 7-AAD dieksitasi ku laser konéng 561 nm teras dideteksi ku filter bandpass 675/20 nm pikeun ngaluarkeun sél anu paéh. Pikeun misahkeun astrosit dina waktos anu sami, suspensi sél diwarnaan ku ACSA-2-APC, teras sampel diiradiasi ku garis laser 640 nm, sareng filter bandpass 660/20 nm dianggo pikeun ngadeteksi sinyal.
Sél-sél anu dikumpulkeun dipélét ku cara séntrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) teras disimpen dina suhu -80°C dugi ka dianggo. Tikus Mfn2cKO sareng anak-anakna diklasifikasikeun dina dinten anu sami pikeun ngaminimalkeun variabilitas prosedural. Presentasi sareng analisis data FACS dilaksanakeun nganggo parangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, AS).
Sakumaha anu parantos disebatkeun di luhur (59), PCR waktos nyata dianggo pikeun ngasingkeun DNA tina neuron anu diurutkeun pikeun kuantifikasi mtDNA salajengna. Linieritas sareng sensitivitas ambang mimitina diuji ku cara ngajalankeun qPCR dina jumlah sél anu béda. Singkatna, kumpulkeun 300 PN dina buffer lisis anu diwangun ku 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 sareng proteinase K (200 ng/ml) teras diinkubasi dina suhu 55°C salami 120 menit. Sél-sél salajengna diinkubasi dina suhu 95°C salami 10 menit pikeun mastikeun inaktivasi lengkep proteinase K. Nganggo probe TaqMan (Thermo Fisher) khusus pikeun mt-Nd1, mtDNA diukur ku PCR semi-kuantitatif dina sistem PCR Waktos Nyata 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Élmu pangaweruh, nomer katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomer katalog AIVI3E8) sareng 18S (Thermo Fisher Scientific, nomer katalog Hs99999901_s1) gén.
Persiapan sampel protéom. Ku cara manaskeun larutan dina suhu 95°C salami 10 menit sareng sonikasi, dina buffer lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida sareng 100 mM pelet neuron beku tris-Lise dina HCl]. Dina Bioruptor (Diagenode) salami 10 menit (30 detik pulsa / 30 detik periode jeda). Sampel diéncérkeun 1:10 dina 20 mM tris-HCl (pH 8.0), dicampur sareng 300 ng tripsin emas (Promega), sareng diinkubasi sapeuting dina suhu 37°C pikeun ngahontal pencernaan anu lengkep. Dina dinten kadua, sampel disentrifugasi dina 20.000 g salami 20 menit. Supernatan diéncérkeun ku asam format 0.1%, sareng larutan didesalén ku StageTips anu didamel nyalira. Sampel dikeringkeun dina alat SpeedVac (konsentrator Eppendorf ditambah 5305) dina suhu 45°C, teras péptida disuspensikeun dina asam format 0,1%. Sadaya sampel disiapkeun sacara simultan ku jalmi anu sami. Pikeun nganalisis sampel astrosit, 4 μg péptida anu didesalurkeun dilabélan ku tag massa tandem (TMT10plex, nomer katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) kalayan babandingan réagen péptida ka TMT 1:20. Pikeun panyiri TMT, 0,8 mg réagen TMT disuspensikeun deui dina 70 μl ACN anhidrat, sareng péptida anu garing dilarutkeun deui kana 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat), anu ditambahkeun 7 μl réagen TMT dina ACN. Konsentrasina nyaéta 43,75%. Saatos 60 menit inkubasi, réaksi dipareuman ku 2 μl 5% hidroksilamin. Péptida anu dilabélan dikumpulkeun, dikeringkeun, disuspensikeun deui dina 200μl asam format 0,1% (FA), dibagi jadi dua, teras didesaluran nganggo StageTips anu didamel sorangan. Nganggo kromatografi cair kinerja ultra luhur UltiMate 3000 (kromatografi cair kinerja ultra luhur UltiMate 3000), salah sahiji tina dua satengahna difraksinasi dina kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm anu dieusi ku partikel C18 130Å1,7μm (Waters, katalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Pisahkeun péptida dina laju aliran 30μl/mnt, pisahkeun tina 1% dugi ka 50% buffer B salami 85 menit kalayan gradien léngkah-léngkah 96 menit, tina 50% dugi ka 95% buffer B salami 3 menit, teras 8 menit pikeun 95% Buffer B; Buffer A nyaéta 5% ACN sareng 10 mM amonium bikarbonat (ABC), sareng buffer B nyaéta 80% ACN sareng 10 mM ABC. Kumpulkeun fraksi unggal 3 menit teras gabungkeun kana dua kelompok (1 + 17, 2 + 18, jsb.) teras garingkeun dina centrifuge vakum.
Analisis LC-MS/MS. Pikeun spéktrométri massa, péptida (nomer r119.aq) dipisahkeun dina kolom analitik PicoFrit diaméter jero 25 cm, 75 μm (lénsa obyektif anyar, nomer bagian PF7508250) anu dilengkepan ku média ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), Anggo EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Kolom dijaga dina suhu 50°C. Buffer A sareng B nyaéta 0,1% asam format dina cai sareng 0,1% asam format dina 80% ACN, masing-masing. Péptida dipisahkeun tina 6% dugi ka 31% buffer B salami 65 menit sareng tina 31% dugi ka 50% buffer B salami 5 menit kalayan gradién 200 nl/mnt. Péptida anu diélusi dianalisis dina spéktrométer massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Pangukuran m/z prékursor péptida dilaksanakeun kalayan résolusi 120.000 dina kisaran 350 dugi ka 1500 m/z. Ngagunakeun énergi tabrakan anu dinormalisasi 27%, prékursor anu pangkuatna kalayan kaayaan muatan 2 dugi ka 6 dipilih pikeun pamisahan disosiasi bubu C (HCD) énergi anu luhur. Waktos siklus disetel ka 1 detik. Nilai m/z tina fragmen péptida diukur dina bubu ion nganggo target AGC pangleutikna 5 × 104 sareng waktos injeksi maksimum 86 ms. Saatos fragmentasi, prékursor disimpen dina daptar pangaluaran dinamis salami 45 detik. Peptida anu dilabélan TMT dipisahkeun dina kolom Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nomer katalog 164942), sareng spéktra migrasi dianalisis dina spéktrométer massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) anu dilengkepan ku alat ion bentuk gelombang asimetris medan tinggi (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) beroperasi dina dua tegangan kompensasi −50 sareng −70 V. MS3 anu dipilih dumasar kana prékursor sinkronisasi dianggo pikeun pangukuran sinyal ion laporan TMT. Pamisahan peptida dilaksanakeun dina EASY-nLC 1200, nganggo élusi gradién linier 90%, kalayan konsentrasi buffer 6% dugi ka 31%; buffer A nyaéta 0,1% FA, sareng buffer B nyaéta 0,1% FA sareng 80% ACN. Kolom analitik dioperasikeun dina suhu 50°C. Anggo FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Scientific) pikeun misahkeun file aslina numutkeun tegangan kompensasi FAIMS.
Idéntifikasi sareng kuantifikasi protéin. Ngagunakeun mesin pencari Andromeda anu terintegrasi, data asli dianalisis nganggo MaxQuant vérsi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Salian ti runtuyan Cre recombinase sareng YFP anu diala tina Aequorea victoria, spéktra fragmen péptida ditéang pikeun runtuyan kanonik sareng runtuyan isoform tina protéom rujukan beurit (ID Protéom UP000000589, diunduh ti UniProt dina Méi 2017). Oksidasi métionin sareng asetilasi N-terminal protéin disetel salaku modifikasi variabel; métilasi sistein karbamoil disetel salaku modifikasi tetep. Parameter pencernaan disetel ka "spésifisitas" sareng "tripsin/P". Jumlah minimum péptida sareng péptida cukur anu dianggo pikeun idéntifikasi protéin nyaéta 1; jumlah minimum péptida unik nyaéta 0. Dina kaayaan cocog peta péptida, laju idéntifikasi protéin nyaéta 0,01. Pilihan "Péptida Kadua" diaktipkeun. Anggo pilihan "cocog antara prosés" pikeun mindahkeun idéntifikasi anu suksés antara file asli anu béda. Anggo jumlah rasio minimum LFQ 1 pikeun kuantifikasi bébas labél (LFQ) (60). Inténsitas LFQ disaring pikeun sahenteuna dua nilai anu valid dina sahenteuna hiji grup genotip dina unggal titik waktos, sareng diekstrapolasi tina distribusi normal kalayan lébar .0,3 sareng turun 1,8. Anggo platform komputasi Perseus (https://maxquant.net/perseus/) sareng R (https://r-project.org/) pikeun nganalisis hasil LFQ. Uji t sedeng dua arah tina pakét parangkat lunak limma dianggo pikeun analisis éksprési diferensial (61). Analisis data éksplorasi dilakukeun nganggo ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally sareng pheatmap. Data protéomik berbasis TMT dianalisis nganggo MaxQuant versi 1.6.10.43. Pilarian data protéomik atah tina database protéomik manusa UniProt, anu diunduh dina Séptémber 2018. Analisisna ngawengku faktor koreksi kamurnian isotop anu disayogikeun ku produsén. Anggo limma dina R pikeun analisis éksprési diferensial. Data asli, hasil pamilarian database, sareng alur kerja sareng hasilna analisis data sadayana disimpen dina aliansi ProteomeXchange ngalangkungan repositori mitra PRIDE kalayan idéntifikasi set data PXD019690.
Anotasi fungsional ngajembaran analisis. Alat Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) dianggo pikeun nangtukeun kabeungharan istilah anotasi fungsional tina set data dina 8 minggu (Gambar 1). Singkatna, daptar protéin kuantitatif anu diala tina analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) dianggo kalayan kriteria filter ieu: Mus musculus dipilih salaku spésiés sareng latar, sareng kategori nunjukkeun nilai P anu disaluyukeun ku Benjamini pikeun pengayaan 0,05 atanapi langkung handap dianggap signifikan. Pikeun grafik ieu, lima kategori kaleuwihan luhur dina unggal klaster dumasar kana nilai P anu disaluyukeun dipidangkeun. Nganggo uji-t ganda, nganggo program dorongan linier dua tahap Benjamini, Krieger, sareng Yekutieli (Q = 5%), analisis éksprési protéin kursus waktos dilakukeun kana calon penting anu diidentifikasi dina unggal kategori, sareng unggal baris dianalisis sacara misah. Teu kedah ngadopsi SD anu konsisten.
Pikeun ngabandingkeun hasil panilitian ieu sareng database anu parantos diterbitkeun sareng ngahasilkeun diagram Venn dina Gambar 1, kami ngagabungkeun daptar protéin kuantitatif sareng anotasi MitoCarta 2.0 (24). Anggo alat online Gambar Diagram Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) pikeun ngahasilkeun diagram.
Kanggo inpormasi lengkep ngeunaan prosedur statistik anu dianggo pikeun analisis protéomik, mangga tingal bagian Bahan sareng Métode anu saluyu. Pikeun sadaya ékspérimén sanésna, inpormasi lengkep tiasa dipendakan dina legenda anu saluyu. Kajaba upami ditangtukeun sanés, sadaya data dikedalkeun salaku rata-rata ± SEM, sareng sadaya analisis statistik dilaksanakeun nganggo parangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Kanggo bahan tambahan pikeun tulisan ieu, mangga tingali http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ieu mangrupikeun artikel aksés kabuka anu disebarkeun dina istilah Lisénsi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, anu ngamungkinkeun panggunaan, distribusi sareng réproduksi dina média naon waé, salami panggunaan akhir sanés pikeun kauntungan komérsial sareng premisna nyaéta karya aslina leres. Rujukan.
Catetan: Kami ngan ukur nyuhunkeun anjeun pikeun masihan alamat email anjeun supados jalmi anu anjeun rekomendasikeun ka halaman éta terang yén anjeun hoyong aranjeunna ningali email éta sareng éta sanés spam. Kami moal ngarékam alamat email naon waé.
Patarosan ieu dianggo pikeun nguji naha anjeun pangunjung sareng nyegah kiriman spam otomatis.
Ku E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis protéomik tina neuron disfungsional ngungkabkeun yén program métabolik diaktipkeun pikeun ngalawan neurodegenerasi.
Ku E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis protéomik tina neuron disfungsional ngungkabkeun yén program métabolik diaktipkeun pikeun ngalawan neurodegenerasi.
© 2020 Asosiasi Amérika pikeun Kamajuan Élmu. sadaya hak disimpen. AAAS mangrupikeun mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef sareng COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.