Ayeuna†Alamat ayeuna: OX11 0DE, Inggris, Gedong Intan, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Kompleks panén cahaya puseur réaksi 1 (RC-LH1) nyaéta komponén inti fotosintésis baktéri fototrofik wungu. Kami ngenalkeun dua struktur mikroskop krio-éléktron tina kompleks RC-LH1 tina Rhodopseudomonas palustris. Struktur résolusi 2,65-Å tina kompleks RC-LH114-W diwangun ku 14 puteran subunit LH1 anu ngurilingan RC, anu diinterupsi ku protéin W, sedengkeun kompleks tanpa protéin-W mangrupikeun komposisi RC lengkep anu dikurilingan ku RC. Puteran LH1 16 subunit anu ditutup. Babandingan struktur ieu masihan wawasan kana dinamika kuinon dina kompleks RC-LH1, kalebet parobahan konformasi anu teu acan ditangtukeun sateuacana nalika ngabeungkeut kuinon di situs RC QB, ogé lokasi situs ngabeungkeut kuinon bantu, anu ngabantosan ngirimkeunana ka RC. Struktur unik protéin W nyegah panutupan puteran LH1, sahingga nyiptakeun saluran pikeun ngagancangkeun pertukaran kuinon/kuinolon.
Énergi anu disayogikeun ku fotosintésis tiasa ngadukung ampir sadaya kahirupan di bumi, sareng éta ngagaduhan poténsi anu ageung pikeun biotéhnologi surya. Sambil ngamajukeun fotosintésis global, baktéri fototrofik ungu ogé nunjukkeun rupa-rupa modeu énergi sareng kamampuan métabolik. Éta tiasa nyingkahan fotosintésis sareng tumbuh salaku baktéri hétérotrofik dina poék, tiasa ngalereskeun nitrogén sareng karbon dioksida, ngahasilkeun hidrogén, sareng ngarecah sanyawa aromatik (1-3). Pikeun nyayogikeun énergi pikeun prosés ieu, cahaya kedah gancang sareng épisién dirobih janten énergi kimia. Prosés ieu dimimitian nalika kompleks anteneu anu nangkep cahaya nyerep cahaya sareng mindahkeun énergi anu nangkep ka pusat réaksi (RC), sahingga ngamimitian pamisahan muatan (4 - 7). Unit dasar fotosintésis dina baktéri fototrofik ungu diwangun ku RC tipe 2, dikurilingan ku kompleks panén cahaya 1 (LH1), ngabentuk kompleks inti RC-LH1. LH1 dibentuk ku susunan heterodimer αβ melengkung, anu masing-masing ngabeungkeut dua molekul klorofil baktéri (BChl) sareng hiji atanapi dua karotenoid (8-12). Antena LH1 anu paling saderhana diwangun ku 16 atanapi 17 heterodimer αβ anu ngurilingan RC (9-13) dina loop katutup, tapi dina kompleks inti anu sanés, péptida transmembran ngaganggu kontinuitas LH1 di sakurilingna, Ku kituna ngamajukeun difusi kuinol/kuinon antara RC sareng kompleks sitokrom bc1 (11, 13-15). Tutuwuhan fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) mangrupikeun organisme modél anu tiasa ngartos transfer énergi sareng éléktron anu ngadukung fotosintésis. Struktur kristal munggaran Rps. Modél kompleks palustris RC-LH1 nyaéta RC, dikurilingan ku 15 loop LH1 heterodimer, anu diinterupsi ku protéin anu teu dipikanyaho anu disebut "Protéin W" (14). Protéin-W salajengna diidentifikasi salaku RPA4402, nyaéta protéin 10,5kDa anu teu dicirikeun kalayan tilu heliks transmembran (TMH) anu diprediksi (16). Kami ngusulkeun pikeun ngaganti ngaran gén rpa4402 anu ngode protéin W ka pufW supados saluyu sareng nomenklatur anu dianggo pikeun gén anu ngode subunit RC-L, M (pufL, pufM) sareng LH1α, β (pufA, pufB). Anu pikaresepeun, protéin-W ngan ukur aya dina sakitar 10% RC-LH1, anu ngungkabkeun Rps. palustris ngahasilkeun dua kompleks RC-LH1 anu béda. Di dieu, kami ngalaporkeun struktur cryo-EM (cryo-EM) résolusi luhur tina dua kompleks inti, hiji kalayan protéin W sareng 14 heterodimer αβ, anu sanésna tanpa protéin W sareng loop LH1 16 Heterodimer anu katutup. Struktur kami ngagambarkeun parobahan léngkah dina pamahaman kompleks RC-LH1 tina Rps. palustris, sabab kami parantos nganalisis populasi homogen tina unggal varian sareng gaduh résolusi anu cekap pikeun nangtukeun sacara jelas unggal péptida sareng pigmén anu kaiket sareng lipid sareng kuinon anu aya hubunganana. Babandingan struktur ieu nunjukkeun yén tilu protéin TMH-W anu teu acan kapanggih dina kompleks RC-LH1 anu sanés dugi ka ayeuna ngahasilkeun saluran kuinon pikeun ngagancangkeun pertukaran kuinon/kuinolon. Sajumlah situs pangiket lipid sareng kuinon anu dilestarikan parantos diidéntifikasi, sareng kami parantos ngungkabkeun parobahan konformasi énggal saatos kombinasi kuinon sareng RC, anu panginten cocog pikeun fotosistem II (PSII) RC organisme fototrofik anu dioksigénasi. Panemuan kami nyayogikeun wawasan énggal kana kinétika pangiket sareng pertukaran kuinon/kuinolon dina kompleks inti RC-LH1 baktéri fototrofik ungu.
Pikeun ngagampangkeun panilitian anu lengkep ngeunaan dua kompleks anu kapanggih dina Rps. palustris, urang ngasingkeun unggal RC-LH1 ku metode biokimia. Kompleks anu kakurangan protéin W (salajengna disebut ΔpufW) dimurnikeun tina galur anu kakurangan gén pufW (16), sareng ngan hiji kompleks RC-LH1 anu tiasa dihasilkeun. Kompleks anu ngandung protéin W dihasilkeun ku hiji galur. Protéin W tina galur ieu dimodifikasi ku tag 10x His dina C-terminusna, supados kompleks anu ngandung protéin W tiasa digabungkeun sacara efektif sareng kalolobaan protéin W anu kakurangan ku cara ngimobilisasi logam. Kompleks ieu dipisahkeun sacara efektif (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 1, duanana kompleks ngandung tilu sub-unit RC (RC-L, RC-M sareng RC-H) anu dikurilingan ku anteneu LH1. Struktur 2.80-A tina kompleks anu kakurangan protéin-W nunjukkeun 16 heterodimer αβ, ngabentuk loop LH1 anu katutup anu ngurilingan RC, salajengna disebut kompleks RC-LH116. Struktur 2.65Å tina kompleks anu ngandung protéin-W ngagaduhan 14-heterodimer LH1 anu diinterupsi ku protéin-W, salajengna disebut RC-LH114-W.
(A sareng B) Répréséntasi permukaan sanyawa. (C sareng D) Pigmén anu kabeungkeut anu diekspresikeun dina batang. (E sareng F) Kompleks anu dititénan tina permukaan sitoplasma ngagaduhan péptida sareng subunit LH1 anu diwakilan dina kartun, sareng dinomeran searah jarum jam tina celah protéin-W [saluyu sareng panomeran Rba. kompleks sphaeroides (13)]. Pikeun LH1-α, warna subunit protéin nyaéta konéng; pikeun LH1-β, warna subunit protéin nyaéta biru; pikeun protéin-W, protéinna nyaéta beureum; pikeun RC-H, éta cyan; pikeun RC-L, éta Oranyeu; pikeun RC-M, magenta. Kofaktor diwakilan ku batang, héjo ngawakilan molekul BChl sareng BPh a, wungu ngawakilan karotenoid, sareng konéng ngawakilan molekul UQ10. (G sareng H) Panempoan anu digedekeun tina celah protéin-W dina daérah anu sami sareng kompleks RC-LH114-W (G) sareng kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor dipidangkeun dina bentuk ngeusian rohangan, kuinon anu dikhelat dipidangkeun dina warna biru. Celah protéin-W disorot ku garis putus-putus biru dina (G), sareng liang leutik dimana kuinon/kuinolol nyebar dina cingcin LH116 disorot ku garis putus-putus hideung dina (H).
Gambar 1 (A sareng B) nunjukkeun RC anu dikurilingan ku susunan heterodimer LH1αβ anu kabuka atanapi katutup, anu masing-masing ngabeungkeut dua BChl sareng hiji karotenoid (Gambar 1, C sareng D). Panilitian sateuacana nunjukkeun yén Rps nyaéta kompleks LH1. Dina jalur biosintésis spirulina xanthin, spésiés ieu ngandung populasi campuran karotenoid (17). Nanging, spiropyrroxanthin nyaéta karotenoid anu dominan sareng kapadetanna nyugemakeun. Ku alatan éta, urang milih modél spiroxanthin di sadaya situs ngabeungkeut LH1. Polipeptida alfa sareng béta nyaéta TMH tunggal kalayan daérah luar mémbran pondok (Gambar 1, A, B, E, sareng F). Sanaos kapadetan 17 résidu di C-terminus henteu dititénan, polipeptida alfa dibelah tina Met1 ka Ala46 dina duanana kompleks. Polipeptida β diréduksi tina Gly4 ka Tyr52 dina RC-LH116, sareng tina Ser5 ka Tyr52 dina RC-LH114-W. Teu aya kapadetan 3 atanapi 4 résidu N-terminal atanapi 13 résidu C-terminal anu katingali (Gambar S1). Analisis spéktrométri massa tina kompleks RC-LH1 campuran anu disiapkeun tina galur tipe liar nunjukkeun yén daérah anu leungit mangrupikeun hasil tina pamotongan hétérolog tina péptida ieu (Gambar S1 sareng S2). Formilasi N-terminal α-Met1 ogé katingali (f). Analisis nunjukkeun yén α-péptida diwangun ku résidu fMet1 ka Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, sareng β-péptida diwangun ku résidu Ser2 ka Ala53, anu saluyu sareng peta kapadetan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 sareng β-His36 ngajantenkeun BChls padeukeut; unggal heterodimer αβ ngahiji sareng tatanggana pikeun ngabentuk loop kabuka (RC-LH114-W) atanapi loop katutup (RC-LH116) di sakitar RC The exciton coupled pigment array (Gambar 1, C sareng D). Dibandingkeun sareng pita 877 nm RC-LH114-W, pergeseran beureum serapan 880 nm RC-LH116 nyaéta 3 nm (Gambar 2A). Nanging, spéktrum dichroism sirkular ampir sami (Gambar 2B), nunjukkeun yén sanaos aya bédana anu jelas antara loop kabuka sareng katutup, lingkungan lokal BChls sami pisan. Pergeseran beureum serapan tiasa janten hasil tina gerakan termal anu dikirangan sareng ningkatna stabilitas dina loop katutup (18, 19), parobahan dina gandéngan pigmén anu disababkeun ku loop katutup (20, 21), atanapi kombinasi tina dua épék ieu (11).
(A) Spéktrum serapan ultraviolét/katingali/deukeut-infra red, puncakna ditandaan ku pigmén anu saluyu sareng dinormalisasi kana puncak BPh dina 775 nm. (B) Spéktrum dikroisme sirkular dinormalisasi kana serapan BChl dina 805 nm. (C sareng D) Spéktra ΔA anu dipilih tina spéktra serapan anu direngsekeun ku waktos tina kompleks RC-LH114-W (C) sareng kompleks RC-LH116 (D). Pikeun babandingan anu langkung saé, sadaya spéktra dinormalisasi kana ∆A tina −A dina 0,2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 saatos iradiasi dina ayana rupa-rupa konsentrasi UQ2 (tingali Gambar S8 pikeun data atah). (F) Dina sél anu dipelak dina cahaya inténsitas rendah, sedeng atanapi luhur (masing-masing 10, 30 atanapi 300μMm-2 s-1), subunit protéin W sareng RC-L dina kompleks anu dimurnikeun sareng babandingan mémbran anu dipisahkeun. Tangtukeun tingkat protéin ku éléktroforésis gél SDS-poliakrilamida sareng immunoassay (tingali Gambar S9 pikeun data atah). Tangtukeun babandingan relatif kana kompleks RC-LH114-W anu dimurnikeun. Babandingan stoikiometri RC-L kana protéin-W tina kompleks nyaéta 1:1.
BChl dina posisi 1 dina loop αβ14 anu cacad tina RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, sareng E) langkung caket kana donor primér RC (P) ku 6,8Å tibatan BChl anu sami dina RC-LH116 (Gambar 1, B, D, sareng F, sareng Gambar S3); kumaha oge, kinétika panyerepan transien tina dua kompleks nunjukkeun yén pikeun RC-LH114-W sareng RC-LH116, konstanta waktos transfer énergi eksitasi ti LH1 ka RC nyaéta 40 ± 4 sareng 44 ± 3 ps (Gambar 2). , C sareng D, Gambar S4 sareng Tabel S2). Ogé teu aya béda anu signifikan dina transfer éléktronik dina RC (Gambar S5 sareng téks tambahan anu aya hubunganana). Kami curiga yén korespondensi anu caket tina waktos transfer énergi antara LH1 sareng RC-P disababkeun ku jarak, sudut sareng énergi poténsial anu sami tina kalolobaan BChl dina dua loop LH1. Sigana mah ngajalajah pola énergi LH1 pikeun ngahontal jarak minimum téh teu leuwih gancang tibatan transfer énergi langsung ti situs suboptimal ka RC. Loop LH1 loop kabuka dina RC-LH114-W ogé bisa ngalaman gerakan termal anu teu signifikan dina kaayaan suhu handap pikeun analisis struktural, sarta aya konformasi cingcin αβ14 anu leuwih panjang dina suhu kamar ti jarak pigmentasi βBChls dina posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 ngandung 32 BChls sareng 16 karotenoid, sareng susunanana sacara umum sami sareng anu diala tina Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), galur Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) sareng ganggang héjo (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Saatos diselaraskeun, ngan ukur panyimpangan leutik dina posisi heterodimer αβ anu dititénan, khususna 1-5, 15, sareng 16 (Gambar S6). Ayana protéin-W gaduh dampak anu signifikan kana struktur LH1. Tilu TMH na dihubungkeun ku puteran pondok, kalayan N-terminal di sisi lumen kompleks sareng C-terminal di sisi sitoplasma (Gambar 1A sareng 3, A dugi ka D). Protéin-W sacara umum hidrofobik (Gambar 3B), sareng TMH2 sareng TMH3 berinteraksi sareng LH1αβ-14 pikeun ngabentuk permukaan transmembran (Gambar 3, B sareng E dugi ka G). Antarbeungeutna utamina diwangun ku résidu Phe, Leu sareng Val di daérah transmembran. Résidu ieu ditumpuk ku asam amino hidrofobik sareng pigmén αβ-14. Sababaraha résidu polar ogé nyumbang kana interaksi, kalebet beungkeut hidrogén antara W-Thr68 sareng β-Trp42 dina permukaan rongga kompléks (Gambar 3, F sareng G). Dina permukaan sitoplasma, Gln34 caket kana gugus keto karotenoid αβ-14. Salaku tambahan, molekul n-dodesil β-d-maltosida (β-DDM) parantos direngsekeun, sareng buntut hidrofobikna manjang ka antarmuka antara protéin-W sareng αβ-14, sareng buntut lipid tiasa aya dina awak. Kami ogé perhatikeun yén daérah résolusi C-terminal protéin W sareng RCH caket pisan, tapi henteu dina ruang lingkup ngabentuk interaksi spésifik (Gambar 1, A sareng E). Nanging, tiasa aya interaksi dina asam amino C-terminal anu teu acan direngsekeun tina dua protéin ieu, anu tiasa nyayogikeun mékanisme pikeun rekrutmen protéin-W nalika perakitan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protéin-W, anu nyanghareup antarmuka sareng LH1αβ14 dina bentuk kartun, ngagaduhan ranté sisi anu bentukna batang (beureum), dipidangkeun dina bagian diagram poténsial éléktrostatik (permukaan kulawu transparan kalayan tingkat kontur 0,13). (B) Protéin-W digambarkeun ku permukaan anu warnana hidrofobik. Daérah polar sareng anu dieusi dipidangkeun dina warna cyan, daérah hidrofobik dipidangkeun dina warna bodas, sareng daérah hidrofobik anu kuat dipidangkeun dina warna oranyeu. (C sareng D) Protéin-W digambarkeun dina kartun, orientasina sami sareng dina (A) (C), sareng diputer ku 180° (D). Numutkeun posisi dina runtuyan, résidu anu tiasa dibédakeun ngadopsi skéma warna pelangi, dimana terminal-N biru sareng terminal-C beureum. (E) Protéin-W dina tampilan anu sami sareng dina (A), sareng résidu dina antarmuka protéin-W:LH1 digambarkeun ku batang kalayan tanda anu napel. (F) Protéin-W diputer 90° relatif ka (E) sareng LH1αβ14 dina representasi kartun, sareng relatif ka résidu antarmuka dina representasi bar. Résidu anu ngagantung tina polipéptida béta dilabélan. Kofaktor dipidangkeun salaku bar anu cocog sareng warna Gambar 1, β-DDM anu diuraikeun dipidangkeun dina warna kulawu, sareng oksigén dipidangkeun dina warna beureum. (G) Panempo dina (F) diputer 180°, kalayan résidu anu nonjol tina polipéptida alfa anu dilabélan.
Protéin-W ngagantikeun heterodimer αβ (ka-15 dina Gambar 1F), ku kituna nyegah panutupan loop sareng miringkeun tilu heterodimer αβ anu munggaran. Katitén yén sudut inklinasi maksimum heterodimer αβ-1 anu munggaran relatif ka normal pilem nyaéta 25° dugi ka 29° (Gambar 1, A sareng E), anu dibentuk ku inklinasi 2° dugi ka 8° tina αβ-1 dina RC A kontras seukeut-LH116 (Gambar 1, B sareng F). Heterodimer kadua sareng katilu condong dina 12° dugi ka 22° sareng 5° dugi ka 10°, masing-masing. Kusabab halangan sterik RC, inklinasi αβ-1 henteu kalebet pasangan kadua αβ (anu pakait sareng αβ ka-16 dina Gambar 1F), ku kituna ngabentuk celah anu jelas dina cincin LH1 (Gambar 1, A sareng E). Kusabab kurangna dua heterodimer αβ, anu dibarengan ku leungitna opat BChl sareng dua karotenoid, teu aya karotenoid anu ngabeungkeut kana subunit αβ-1 anu bengkok, ngahasilkeun cingcin LH114-W anu ngandung 13 karotenoid Vegetarian sareng 28 BChl. Estimasi résolusi lokal tina dua kompleks dina daérah αβ1 dugi ka 7 langkung handap tibatan sésa loop LH1, anu tiasa ngagambarkeun plastisitas bawaan tina subunit LH1 anu caket kana situs RC QB (Gambar 4).
Gambar RC-LH114-W (A sareng B) sareng RC-LH116 (C sareng D) dipidangkeun tina pandangan luhur/pandangan sisi anu sami (A sareng B) (A sareng C) sareng permukaan rongga dina Gambar 1. (B sareng D). Konci berwarna dipidangkeun di katuhu.
Hiji-hijina kompleks inti anu khas kalayan babandingan stoikiometri 1:14 nyaéta dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Nanging, protéin W sareng PufX teu gaduh homologi anu jelas, sareng gaduh dampak anu signifikan kana struktur LH1 masing-masing. PufX mangrupikeun TMH tunggal kalayan domain sitoplasmik N-terminal anu berinteraksi sareng sisi sitoplasmik subunit RC-H (13) dina posisi anu saluyu sareng Rps. palustris LH116αβ-16. PufX nyiptakeun saluran pikeun pertukaran kuinolon/kuinolon antara RC-LH1 sareng kompleks sitokrom bcl sareng aya dina sadaya kompleks inti Rba. sphaeroides (13). Sanaos antarmuka monomer-monomer aya dina Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX ayana dina posisi ngabeungkeut protéin W dina RC-LH114-W, sareng celah anu diinduksi ku PufX sareng protéin-W aya dina posisi anu sami (Gambar S7A). Celah dina RC-LH114-W ogé saluyu sareng saluran kuinon hipotétis (8) tina Pseudomonas rosea LH1, anu dibentuk ku péptida anu henteu aya hubunganana sareng protéin W atanapi PufX (Gambar S7B). Salian ti éta, saluran kuinon dina Blc. LH1 héjo zamrud anu dibentuk ku cara ngaluarkeun hiji subunit γ (7) ayana dina posisi anu sami (Gambar S7C). Sanaos dimediasi ku protéin anu béda, penampilan saluran kuinon/kuinolol ieu dina posisi umum dina kompleks RC-LH1 sigana mangrupikeun conto évolusi konvergen, nunjukkeun yén celah anu didamel ku protéin W tiasa bertindak salaku saluran kuinon.
Celah dina loop LH114-W ngamungkinkeun formasi daérah mémbran kontinyu antara rohangan internal kompleks RC-LH114-W sareng mémbran bulk (Gambar 1G), tinimbang nyambungkeun dua domain ngalangkungan pori protéin sapertos dina protéin. Kompleks RC-LH116 sami sareng kompleks sapertos jarum Tch anu katutup (22) (Gambar 1H). Kusabab difusi kuinon ngalangkungan mémbran langkung gancang tibatan difusi ngalangkungan saluran protéin anu sempit, loop LH114-W anu kabuka tiasa ngamungkinkeun pergantian RC anu langkung gancang tibatan loop LH116 anu katutup, sareng difusi kuinon kana RC tiasa langkung diwatesan. Pikeun nguji naha protéin W mangaruhan konvérsi kuinon ngalangkungan RC, kami ngalaksanakeun uji oksidasi sitokrom dina konsentrasi ubiquinone 2 (UQ2) anu tangtu (analog UQ10 alami kalayan buntut isoprena anu langkung pondok) (Gambar 2E). Sanaos ayana kuinon khelat ngahalangan panangtuan anu akurat tina konstanta Michaelis anu katingali (RC-LH114-W sareng RC-LH116 cocog pikeun 0,2 ± 0,1 μM sareng 0,5 ± 0,2 μM, masing-masing), laju maksimum RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) nyaéta 28 ± 5% langkung ageung tibatan RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Mimitina kami ngira-ngira yén protéin-W aya dina sakitar 10% tina kompleks inti (16); di dieu, tingkat okupansi sél pertumbuhan cahaya rendah, cahaya sedeng, sareng cahaya tinggi masing-masing nyaéta 15 ± 0,6%, 11 ± 1% sareng 0,9 ± 0,5% (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spéktrométri massa nunjukkeun yén panambahan tag histidin henteu ngirangan kelimpahan relatif protéin-W dibandingkeun sareng galur tipe liar (P = 0,59), janten tingkat ieu sanés artefak tina protéin-W anu dimodifikasi (Gambar S10). Nanging, okupansi protéin-W anu handap dina kompleks RC-LH1 ieu tiasa ngamungkinkeun sababaraha RC pikeun ngabalikeun dina laju anu langkung gancang, sahingga ngirangan pertukaran kuinolon/kuinolon anu langkung laun dina kompleks RC-LH116. Kami perhatikeun yén tingkat okupansi cahaya anu luhur henteu konsisten sareng data transkriptomik anyar, anu nunjukkeun yén éksprési gén pufW ningkat dina cahaya anu kuat (Gambar S11) (23). Bédana antara transkripsi pufW sareng penggabungan protéin-W kana kompleks RC-LH1 matak bingung sareng tiasa ngagambarkeun régulasi protéin anu kompléks.
Dina RC-LH114-W, 6 molekul kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) sareng 29 molekul β-DDM dialokasikeun sareng dimodelkeun di jerona 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG sareng 12 βDDM. RC-LH116 (Gambar 5, A sareng B). Dina dua struktur ieu, CDL ampir aya di sisi sitoplasma kompleks, sedengkeun POPC, POPG sareng β-DDM biasana aya di sisi luminal. Dua molekul lipid sareng deterjen diisolasi di daérah αβ-1 dugi ka αβ-6 tina kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), sareng lima diisolasi di daérah anu sami sareng RC-LH116 (Gambar 5B). Langkung seueur lipid anu kapendak di sisi séjén tina kompleks éta, utamina CDL, akumulasi antara RC sareng αβ-7 dugi ka αβ-13 (Gambar 5, A sareng B). Lipid sareng deterjen anu direngsekeun sacara struktural sanésna ayana di luar cincin LH1, sareng ranté asil anu direngsekeun kalayan saé manjang antara subunit LH1, sacara samentawis ditunjuk salaku β-DDM dina RC-LH114-W, sareng dihartikeun salaku β-DDM dina RC Campuran β-DDM sareng POPC-LH116. Posisi lipid chelating sareng deterjen anu sami dina struktur urang nunjukkeun yén éta mangrupikeun situs pangiket anu relevan sacara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul anu sami dina Tch ogé gaduh konsistensi anu saé. Gentle sareng Trv. Galur 970 RC-LH1s (Gambar S12, B dugi ka E) (9, 12) sareng résidu ikatan hidrogén tina gugus sirah lipid nunjukkeun konservasi anu lumayan saé dina panyelarasan runtuyan (Gambar S13), nunjukkeun yén CDL anu dilestarikan anu ngabeungkeut RC (24), situs-situs ieu tiasa dilestarikan dina kompleks RC-LH1.
(A sareng B) Péptida RC-LH114-W (A) sareng RC-LH116 (B) digambarkeun ku kartun, sareng pigmén digambarkeun ku rod, nganggo skéma warna dina Gambar 1. Lipid dipidangkeun dina warna beureum, sareng deterjen dipidangkeun dina warna kulawu. UQ anu kabeungkeut kana situs RC QA sareng QB warnana konéng, sedengkeun UQ anu diisolasi warnana biru. (C sareng D) Panempoan anu sami sareng (A) sareng (B), kalayan lipid anu dileungitkeun. (E ka G) Panempoan anu digedekeun tina Q1(E), Q2(F) sareng Q3(G) tina RC-LH116, kalayan ranté sisi anu silih pangaruh. Beungkeut hidrogén dipidangkeun salaku garis putus-putus hideung.
Dina RC-LH116, duanana RC QA sareng QB UQ, anu milu dina transfer éléktron dina prosés pamisahan muatan, diuraikeun dina situs pangiketna. Nanging, dina RC-LH114-W, QB kuinon tacan direngsekeun sareng bakal dibahas sacara rinci di handap. Salian ti QA sareng QB kuinon, dua molekul UQ anu dikhelat (aya di antara cincin RC sareng LH1) dialokasikeun dina struktur RC-LH114-W numutkeun gugus sirah anu direngsekeun kalayan saé (aya di Q1 sareng Q2, masing-masing). rohangan). Gambar 5C). Dua unit isoprena ditugaskeun ka Q1, sareng peta kapadetan ngarengsekeun 10 buntut isoprena lengkep tina Q2. Dina struktur RC-LH116, tilu molekul UQ10 anu dikhelat (Q1 dugi ka Q3, Gambar 5D) direngsekeun, sareng sadaya molekul gaduh kapadetan anu jelas di sapanjang buntut (Gambar 5, D dugi ka G). Dina dua struktur éta, posisi gugus sirah kuinon Q1 sareng Q2 gaduh konsistensi anu saé pisan (Gambar S12F), sareng aranjeunna ngan ukur berinteraksi sareng RC. Q1 ayana di lawang celah W RC-LH114-W (Gambar 1G sareng 5, C, D sareng E), sareng Q2 ayana di caket situs pangiket QB (Gambar 5, C, D) sareng F). Résidu L-Trp143 sareng L-Trp269 anu dilestarikan caket pisan sareng Q1 sareng Q2 sareng nyayogikeun interaksi π-stacking poténsial (Gambar 5, E sareng F, sareng Gambar S12). L-Gln88, 3.0 Å tina oksigén distal Q1, nyayogikeun beungkeut hidrogén anu kuat (Gambar 5E); résidu ieu dilestarikan dina sadaya RC kecuali hubungan anu paling jauh (Gambar S13). L-Ser91 sacara konservatif digantikeun pikeun Thr dina kalolobaan RC anu sanés (Gambar S13), nyaéta 3,8 Angstrom tina oksigén métil Q1, sareng tiasa nyayogikeun beungkeut hidrogén anu lemah (Gambar 5E). Q3 sigana henteu gaduh interaksi anu khusus, tapi ayana di daérah hidrofobik antara subunit RC-M sareng subunit LH1-α 5 dugi ka 6 (Gambar 5, D sareng G). Q1, Q2 sareng Q3 atanapi kuinon khelat caket dieu ogé parantos direngsekeun dina Tch. Gentle, Trv. Strain 970 sareng Blc. Struktur iris (9, 10, 12) nunjukkeun situs pangiket kuinon bantu anu dilestarikan dina kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Lima UQ anu diuraikeun dina RC-LH116 saluyu sareng 5,8 ± 0,7 tina unggal kompleks anu ditangtukeun ku kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), sedengkeun tilu UQ anu diuraikeun dina RC-LH114-W langkung handap tibatan Nilai anu diukur 6,2 ± 0,3 (Gambar S14) nunjukkeun yén aya molekul UQ anu teu acan direngsekeun dina strukturna.
Polipeptida L sareng M pseudo-simetris masing-masing ngandung lima TMH sareng ngabentuk heterodimer anu ngagabungkeun hiji dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofag (BPh), sareng hiji beusi non-Heme sareng hiji atanapi dua molekul UQ10. Ngaliwatan ayana beungkeut hidrogén dina gugus keton terminal sareng akumulasi anu dipikanyaho dina Rps, karotenoid dilebetkeun kana subunit-M, anu dingaranan cis-3,4-dehydroorhodopin. Spésiés (25). Domain mémbran luar RC-H dijangkarkeun kana mémbran ku hiji TMH. Struktur RC sacara umum sami sareng tilu subunit RC tina spésiés anu aya hubunganana (sapertos Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Makrosiklus BChl sareng BPh, tulang tonggong karotenoid sareng beusi non-heme tumpang tindih dina rentang résolusi struktur ieu, sapertos gugus sirah UQ10 di situs QA sareng QB quinone di RC-LH116 (Gambar S15).
Kasadiaan dua struktur RC kalayan tingkat okupansi situs QB anu béda nyayogikeun kasempetan énggal pikeun nalungtik parobahan konformasi anu konsisten anu ngiringan beungkeutan QB quinone. Dina kompleks RC-LH116, QB quinone ayana dina posisi "proksimal" anu kabeungkeut pinuh (26), tapi pamisahan RC-LH114-W henteu ngagaduhan QB quinone. Teu aya QB quinone dina RC-LH114-W, anu matak héran sabab kompleks ieu aktip, langkung ti kompleks RC-LH116 kalayan QB quinone anu direngsekeun sacara struktural. Sanaos dua cincin LH1 ngakelat sakitar genep kuinon, lima sacara struktural direngsekeun dina cincin RC-LH116 anu katutup, sedengkeun ngan tilu anu diwatesan sacara struktural dina cincin RC-LH114-W anu kabuka. Gangguan struktural anu ningkat ieu tiasa ngagambarkeun panggantian situs QB RC-LH114-W anu langkung gancang, kinétika kuinon anu langkung gancang dina kompleks, sareng ningkatna kamungkinan meuntas loop LH1. Kami ngajukeun yén kurangna UQ dina situs RC QB RC-LH114-W tiasa janten hasil tina kompleks anu langkung rumit sareng langkung aktif, sareng situs QB RC-LH114-W langsung beku dina pergantian UQ. Tahap khusus (lawang ka situs QB parantos ditutup) ngagambarkeun konformasi kagiatan ieu.
Tanpa QB, rotasi L-Phe217 anu ngiringan kana posisi anu teu cocog sareng pangiket UQ10, sabab éta bakal nyababkeun tabrakan spasial sareng unit isoprena munggaran tina buntut (Gambar 6A). Salian ti éta, parobahan konformasi utama anu jelas jelas, khususna helix de (helix pondok dina loop antara TMH D sareng E) dimana L-Phe217 digeser ka kantong pangiket QB sareng rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A) Pikeun megatkeun beungkeut hidrogén sareng kerangka M-Asp45 sareng nutup lawang situs pangiket QB (Gambar 6B). Helix de pivots dina dasarna, Cα tina L-Ser209 digeser ku 0,33Å, sedengkeun L-Val221Cα digeser ku 3,52Å. Teu aya parobahan anu tiasa dititénan dina TMH D sareng E, anu tiasa ditumpangkeun dina duanana struktur (Gambar 6A). Sakumaha anu urang terang, ieu mangrupikeun struktur munggaran dina RC alami anu nutup situs QB. Babandingan sareng struktur lengkep (anu kaiket ku QB) nunjukkeun yén sateuacan kuinon diréduksi, parobihan konformasi diperyogikeun pikeun ngajantenkeun éta lebet kana kuinon. L-Phe217 muter pikeun ngabentuk interaksi π-stacking sareng gugus sirah kuinon, sareng heliksna ngageser ka luar, ngamungkinkeun rorongkong L-Gly222 sareng ranté sisi L-Tyr223 ngabentuk jaringan beungkeut hidrogén kalayan struktur beungkeut hidrogén anu stabil (Gambar 6, A sareng C).
(A) Kartun hologram anu tumpang tindih (ranté L, ranté oranyeu/M, magenta) sareng struktur apo (abu-abu), dimana résidu konci dipidangkeun dina bentuk répréséntasi sapertos rod. UQ10 digambarkeun ku garis konéng. Garis putus-putus nunjukkeun beungkeut hidrogén anu kabentuk dina sakabéh struktur. (B sareng C) Répréséntasi permukaan apolipoprotein sareng sakabéh struktur cingcin, nyorot oksigén ranté samping L-Phe217 dina warna biru sareng L-Tyr223 dina warna beureum, masing-masing. Subunit L warnana oranyeu; subunit M sareng H henteu diwarnaan. (D sareng E) Apolipoprotein (D) sareng sakabéhna (E) situs RC QB [warnaan ku (A) masing-masing] sareng Thermophilus thermophilus PSII (héjo, biru kalayan kuinon plastik; ID PDB: 3WU2) Sejajar (58).
Teu disangka-sangka, sanaos aya sababaraha struktur RC anu kakurangan QB tanpa LH1, parobahan konformasi anu dititénan dina panilitian ieu teu acan dilaporkeun sateuacanna. Ieu kalebet struktur deplesi QB tina Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) sareng Rba. sphaeroides (ID PDB: 1OGV) (29), anu sadayana ampir sami sareng struktur QB sacara umum. Pamariksaan anu caket kana 3PRC ngungkabkeun yén molekul deterjen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ngabeungkeut dina lawang posisi QB, anu tiasa nyegah pangaturan ulang kana konformasi anu katutup. Sanaos LDAO henteu terurai dina posisi anu sami dina 1EYS atanapi 1OGV, RC ieu disiapkeun nganggo deterjen anu sami sareng ku kituna tiasa ngahasilkeun pangaruh anu sami. Struktur kristal Rba. Sphaeroides RC anu dikristalisasi babarengan jeung sitokrom c2 (ID PDB: 1L9B) ogé sigana boga situs QB anu katutup. Nanging, dina hal ieu, daérah N-terminal tina polipéptida RC-M (anu berinteraksi jeung situs pangiket QB ngaliwatan beungkeut H tina résidu Tyr dina Q helix) ngadopsi konformasi anu teu wajar, sareng parobahan konformasi QB teu ditalungtik deui (30). Anu ngayakinkeun nyaéta urang teu acan ningali deformasi polipéptida M sapertos kieu dina struktur RC-LH114-W, anu ampir sami sareng daérah N-terminal RC-LH116 RC. Perlu dicatet ogé yén saatos eradikasi anteneu LH1 anu didasarkeun kana deterjen, apolipoprotein RC dina PDB direngsekeun, anu ngaleungitkeun kolam kuinon internal sareng lipid dina celah antara RC sareng permukaan jero cincin LH1 di sakurilingna (31, 32). RC tetep fungsina sabab nahan sadaya kofaktor, kecuali kuinon QB anu tiasa diuraikeun, anu kirang stabil sareng sering leungit nalika prosés persiapan (33). Salian ti éta, dipikanyaho yén panyabutan LH1 sareng lipid siklik alami tina RC tiasa gaduh dampak kana fungsi, sapertos umur anu pondok tina kaayaan P+QB anu dipisahkeun ku muatan (31, 34, 35). Ku alatan éta, urang ngaduga yén ayana cincin LH1 lokal anu ngurilingan RC tiasa ngajaga situs QB anu "katutup", ku kituna ngajaga lingkungan lokal caket QB.
Sanaos apolipoprotein (tanpa QB quinone) sareng struktur lengkepna ngan ukur ngagambarkeun dua gambaran tina pergantian situs QB, tinimbang runtuyan kajadian, aya indikasi yén pangiketna tiasa dikontrol pikeun nyegah pangiket deui ku hidrokuinon Pikeun ngahambat inhibisi substrat. Interaksi quinolol sareng quinone caket situs QB apolipoprotein tiasa béda, anu nyababkeun panolakanana ku RC. Geus lila diusulkeun yén parobahan konformasional maénkeun peran dina pangiket sareng réduksi quinone. Kamampuh RC beku pikeun ngirangan quinone saatos adaptasi poék kaganggu (36); Kristalografi sinar-X nunjukkeun yén karusakan ieu disababkeun ku QB quinon anu kajebak dina konformasi "distal" sakitar 4,5 Å ti posisi proksimal aktif (26), 37). Kami nyarankeun yén konformasi pangiket distal ieu mangrupikeun gambaran tina kaayaan panengah antara apolipoprotein sareng struktur cingcin lengkep, anu nuturkeun interaksi awal sareng quinone sareng bubuka situs QB.
RC tipe II anu kapanggih dina kompleks PSII baktéri fototrofik sareng sianobaktéri, ganggang sareng pepelakan ngagaduhan konservasi struktural sareng fungsional (38). Panyelarasan struktural anu dipidangkeun dina Gambar 6 (D sareng E) nekenkeun kamiripan antara RC PSII sareng situs QB tina kompleks RC baktéri. Perbandingan ieu parantos lami janten modél pikeun nalungtik sistem anu raket patalina tina pangiket sareng réduksi kuinon. Publikasi sateuacana nunjukkeun yén parobahan konformasional dibarengan ku réduksi kuinon PSII (39, 40). Ku alatan éta, ngémutan konservasi évolusionér RC, mékanisme pangiket anu sateuacanna teu katingali ieu ogé tiasa diterapkeun kana situs QB RC PSII dina pepelakan fototrofik anu dioksigénasi.
Rps ΔpufW (hapusan pufW anu teu dilabélan) sareng galur PufW-His (protéin-W anu ditandaan C-terminal 10x His anu diekspresikeun tina lokus pufW alami). palustris CGA009 parantos dijelaskeun dina karya kami sateuacanna (16). Galur ieu sareng induk tipe liar isogenic dicandak tina freezer ku cara ngagariskeun sajumlah alit sél dina pelat PYE (masing-masing 5 g liter -1) (disimpen dina LB dina suhu -80 °C, ngandung 50% (w/v) gliserol) protéin, ekstrak ragi sareng agar suksinat) [1,5% (w/v)]. Pelat diinkubasi sapeuting dina poék dina suhu kamar dina kaayaan anaérob, teras disinari ku cahaya bodas (~50 μmolm-2 s-1) anu disayogikeun ku bohlam halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) salami 3 dugi ka 5 dinten dugi ka hiji koloni muncul. Hiji koloni dianggo pikeun nginokulasi 10 ml média M22+ (41) anu ditambah ku 0,1% (w/v) asam kasamino (salajengna disebut M22). Kultur ieu dipelak dina kaayaan oksigén anu handap dina poék dina suhu 34°C kalayan dikocok dina 180 rpm salami 48 jam, teras 70 ml kultur diinokulasi dina kaayaan anu sami salami 24 jam. Kultur semi-aerobik kalayan volume 1 ml dianggo pikeun nginokulasi 30 ml média M22 dina botol kaca transparan universal 30 ml sareng diiradiasi ku agitasi (~50μmolm-2 s-1) salami 48 jam ku gaya magnét steril Batang pengaduk. Teras 30 ml kultur diinokulasi ku sakitar 1 liter kultur dina kaayaan anu sami, anu teras dianggo pikeun nginokulasi sakitar 9 liter kultur anu disinari dina ~200 μmolm-2 s-1 salami 72 jam. Sél-sélna dipanén ku cara sentrifugasi dina 7132 RCF salami 30 menit, disuspensikeun deui dina ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), teras disimpen dina suhu -20°C dugi ka diperyogikeun.
Saatos dicairkeun, tambahkeun sababaraha kristal deoxyribonuclease I (Merck, Inggris), lisozim (Merck, Inggris) sareng dua tablet Roche holoenzyme protease inhibitor (Merck, Inggris) kana sél anu disuspensikeun deui. Dina sél tekanan Perancis 20.000 psi (Aminco, AS), sél-sél éta diuraikeun 8 dugi ka 12 kali. Saatos miceun sél anu teu pegat sareng lebu anu teu leyur ku cara sentrifugasi dina 18.500 RCF salami 15 menit dina suhu 4°C, mémbran diendapkeun tina lisat anu dipigmén ku cara sentrifugasi dina 113.000 RCF salami 2 jam dina suhu 43.000°C. Buang fraksi anu leyur sareng suspensikeun deui mémbran anu diwarnaan dina 100 dugi ka 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) teras homogenkeun dugi ka teu aya agrégat anu katingali. Mémbran anu digantungkeun diinkubasi dina 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, AS) anu ngandung 2% (w/v) β-DDM salami 1 jam dina tempat anu poék dina suhu 4°C bari diaduk lalaunan. Teras disentrifugasi dina suhu 70°C pikeun ngaleyurkeun 150.000 RCF dina suhu 4°C salami 1 jam pikeun miceun sésa-sésa anu teu leyur.
Mémbran solubilisasi tina galur ΔpufW diterapkeun kana kolom pertukaran ion DEAE Sepharose 50 ml kalayan tilu volume kolom (CV) buffer pangiket [20 mM tris-HCl (pH 8.0) anu ngandung 0.03% (w/v) β-DDM]. Kumbah kolom ku dua buffer pangiket CV, teras kumbah kolom ku dua buffer pangiket anu ngandung 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 dielusi ku gradien linier 150 dugi ka 300 mM NaCl (dina buffer pangiket) dina 1.75 CV, sareng kompleks pangiket anu sésana dielusi ku buffer pangiket anu ngandung 300 mM NaCl dina 0.5 CV. Kumpulkeun spéktrum serapan antara 250 sareng 1000 nm, jaga fraksi kalayan babandingan serapan (A880/A280) langkung ageung tibatan 1 dina 880 dugi ka 280 nm, éncérkeun dua kali dina buffer pangiket, teras anggo prosedur anu sami deui dina kolom DEAE Dina purifikasi. Éncérkeun fraksi kalayan babandingan A880/A280 anu langkung luhur tibatan 1,7 sareng babandingan A880/A805 anu langkung luhur tibatan 3,0, laksanakeun puteran katilu pertukaran ion, sareng jaga fraksi kalayan babandingan A880/A280 anu langkung luhur tibatan 2,2 sareng babandingan A880/A805 anu langkung luhur tibatan 5,0. Kompleks anu parantos dimurnikeun sawaréh dipekatkeun dugi ka ~2 ml dina filter sentrifugal Amicon 100.000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, Inggris), teras dimuat dina kolom éksklusi ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, AS) anu ngandung buffer NaCl 200 mM, teras diélusi dina buffer anu sami dina 1,5 CV. Kumpulkeun spéktra panyerepan tina fraksi éksklusi ukuran, teras pekatkeun spéktra panyerepan kalayan babandingan A880/A280 langkung ti 2,4 sareng babandingan A880/A805 langkung ti 5,8 dugi ka 100 A880, teras langsung dianggo pikeun persiapan atanapi panyimpenan grid cryo-TEM. Simpen dina suhu -80°C dugi ka diperyogikeun.
Mémbran solubilisasi tina galur PufW-His diterapkeun kana kolom HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) anu ngandung 200 mM NaCl sareng 0.03% (w/w)) dina buffer IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolom dikumbah ku lima CV buffer IMAC, teras ku lima CV buffer IMAC anu ngandung 10 mM histidin. Kompleks inti diélusi tina kolom ku lima buffer IMAC anu ngandung 100 mM histidin. Fraksi anu ngandung kompleks RC-LH114-W dipekatkeun dugi ka ~10 ml dina tangki anu diaduk anu dilengkepan filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, Inggris), diéncérkeun 20 kali ku buffer pangiket, teras ditambahkeun kana 25 ml Dina kolom DEAE Sepharose, opat CV anu kabeungkeut kana buffer dianggo sateuacanna. Kumbah kolom ku opat buffer pangiket CV, teras élusi kompleks dina dalapan CV dina gradien linier 0 dugi ka 100 mM NaCl (dina buffer pangiket), sareng opat CV sésana ngandung buffer pangiket 100 mM. Kompleks sésa anu diélusi dina natrium klorida digabungkeun sareng rasio A880/A280 anu langkung luhur tibatan 2,4 sareng rasio A880/A805 anu langkung luhur tibatan 4,6 fraksi dipekatkeun janten ~2 ml dina filter séntrifugal Amicon 100.000 MWCO, teras dieusi ku 1,5 CV IMAC sateuacanna. Buffer ngimbangan kolom éksklusi ukuran Superdex 200 16/600, teras diélusi dina buffer anu sami langkung ti 1,5 CV. Kumpulkeun spéktra serapan tina fraksi éksklusi ukuran teras pekatkeun spéktra serapan kalayan babandingan A880/A280 di luhur 2.1 sareng babandingan A880/A805 di luhur 4.6 dugi ka 100 A880, anu langsung dianggo pikeun persiapan grid TEM beku atanapi disimpen dina suhu -80°C dugi ka diperyogikeun.
Freezer immersion Leica EM GP dianggo pikeun nyiapkeun grid TEM suhu rendah. Kompleks ieu diéncérkeun dina buffer IMAC ka A880 50, teras 5μl dimuat kana bolong tambaga QUANTIFOIL 1.2/1.3 anu dilapis karbon anu nembé disinari cahaya (Agar Scientific, Inggris). Inkubasi grid dina suhu 20°C sareng kalembaban relatif 60% salami 30 detik, teras garingkeun salami 3 detik, teras pareuman dina étana cair dina suhu -176°C.
Data tina kompleks RC-LH114-W dirékam dina eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) nganggo mikroskop Titan Krios, anu jalan dina tegangan akselerasi 300kV, kalayan pembesaran nominal 130.000× sareng énergi 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum kalayan detektor puncak K2 dianggo pikeun ngarékam gambar dina modeu cacah pikeun ngumpulkeun data. Ukuran piksel anu dikalibrasi nyaéta 1,048Å, sareng laju dosis nyaéta 3,83 e-Å-2s-1. Ngumpulkeun pilem dina 11 detik sareng ngabagi kana 40 bagian. Anggo daérah anu dilapis karbon pikeun museurkeun deui mikroskop, teras kumpulkeun tilu pilem per liang. Sacara total, 3130 pilem dikumpulkeun, kalayan nilai defokus antara -1 sareng -3μm.
Data pikeun kompleks RC-LH116 dikumpulkeun nganggo mikroskop anu sami di Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data dikumpulkeun dina modeu cacah kalayan pembesaran 130 k, sareng ukuran piksel dikalibrasi dugi ka 1,065 Å kalayan dosis 4,6 e-Å-2s-1. Pilem ieu dirékam dina 12 detik sareng dibagi kana 48 bagian. Sacara total, 3359 pilem dikumpulkeun, kalayan nilai defokus antara -1 sareng -3μm.
Sadaya pamrosésan data dilaksanakeun dina pipa Relion 3.0 (42). Anggo Motioncorr 2 (43) pikeun ngabenerkeun gerakan sinar ku cara ngabobotkeun dosis, teras anggo CTFFIND 4.1 (44) pikeun nangtukeun parameter CTF (fungsi transfer kontras). Fotomikrograf has saatos tahapan pamrosésan awal ieu dipidangkeun dina Gambar 2. S16. Citakan pilihan otomatis dihasilkeun ku cara milih sacara manual sakitar 250 piksel tina 1000 partikel dina pigura 250 piksel sareng henteu aya klasifikasi dua diménsi (2D) rujukan, ku kituna nolak klasifikasi anu nyumponan kontaminasi sampel atanapi henteu gaduh ciri anu tiasa dibédakeun. Teras, pilihan otomatis dilaksanakeun dina sadaya mikrofotograf, sareng RC-LH114-W nyaéta 849.359 partikel, sareng kompleks RC-LH116 nyaéta 476.547 partikel. Sadaya partikel anu dipilih parantos ngalaman dua puteran klasifikasi 2D non-rujukan, sareng saatos unggal prosés, partikel anu nyumponan daérah karbon, kontaminasi sampel, teu aya fitur anu jelas atanapi partikel anu tumpang tindih pisan ditolak, anu ngahasilkeun 772.033 (90,9%) sareng 359.678 (75,5%) Partikel dianggo pikeun klasifikasi 3D RC-LH114-W sareng RC-LH116 masing-masing. Modél rujukan 3D awal dihasilkeun nganggo metode turunan gradien stokastik. Nganggo modél awal salaku rujukan, partikel anu dipilih diklasifikasikeun kana opat kategori dina 3D. Nganggo modél dina kategori ieu salaku rujukan, laksanakeun pamurnian 3D dina partikel dina kategori panggedéna, teras anggo filter low-pass 15Å awal pikeun nutupan daérah pangleyur, tambahkeun 6 piksel ujung lemes, sareng pasca-prosés piksel pikeun ngabenerkeun fungsi transfer Modulasi puncak Gatan K2 tina detektor luhur. Pikeun sét data RC-LH114-W, modél awal ieu dirobah ku cara miceun kapadetan anu kuat di sisi topéng (dipegatkeun tina kapadetan kompléks inti dina UCSF Chimera). Modél anu dihasilkeun (résolusi RC-LH114-W sareng RC-LH116 masing-masing nyaéta 3,91 sareng 4,16 Å) dianggo salaku rujukan pikeun babak kadua klasifikasi 3D. Partikel anu dianggo dikelompokkeun kana kelas 3D awal sareng henteu ngandung korélasi anu kuat sareng lingkunganana. Tumpang tindih atanapi kurangna fitur struktural anu jelas. Saatos babak kadua klasifikasi 3D, kategori anu gaduh résolusi pangluhurna dipilih [Pikeun RC-LH114-W, hiji kategori nyaéta 377.703 partikel (44,5%), pikeun RC-LH116, aya dua kategori, jumlahna 260.752 partikel (54,7%), dimana sami ngan ukur nalika dijajarkeun saatos rotasi awal kalayan bédana anu alit]. Partikel-partikel anu dipilih diekstrak deui dina kotak 400 piksel sareng dimurnikeun ku pamurnian 3D. Topéng pangleyur dihasilkeun nganggo filter low-pass awal 15Å, ékspansi peta 3 piksel sareng topéng lemes 3 piksel. Nganggo pamurnian CTF per-partikel, koreksi gerakan per-partikel sareng puteran kadua pamurnian CTF per-partikel, pamurnian 3D, pamurnian pangleyur sareng pasca-pamrosésan dilakukeun saatos unggal léngkah pikeun langkung nyaring tékstur anu dihasilkeun. Nganggo nilai cut-off FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0,143, résolusi modél ahir RC-LH114-W sareng RC-LH116 masing-masing nyaéta 2,65 sareng 2,80Å. Kurva FSC tina modél ahir dipidangkeun dina Gambar 2. S17.
Sadaya runtuyan protéin diunduh tina UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) dianggo pikeun ngawangun modél homologi RC, anu ngandung runtuyan protéin RC-L, RC-M sareng RC-H sareng struktur kristal Rba. sphaeroides RC dianggo salaku citakan (PDB ID: 5LSE) (46). Anggo alat "fit map" dina UCSF Chimera pikeun nyocogkeun modél anu dihasilkeun kana peta (47), ningkatkeun struktur protéin, sareng kofaktor [4×BChl a (ngaran résidu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), hiji atanapi dua jinis UQ10 (U10), hiji beusi non-heme (Fe) sareng hiji 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] anggo Coot (48) pikeun nambihan. Kusabab QAK henteu sayogi dina perpustakaan monomer, éta diparameterisasi nganggo alat eLBOW dina PHENIX (49).
Salajengna, subunit LH1 diwangun. Mimitina, alat konstruksi otomatis dina PHENIX (49) dianggo pikeun sacara otomatis ngawangun sabagian tina runtuyan LH1 nganggo peta sareng runtuyan protéin LH1-α sareng LH1-β salaku input. Pilih subunit LH1 anu paling lengkep, ekstrak teras muatkeun kana Coot, tambahkeun sacara manual runtuyan anu leungit di jerona, teras saring sadayana struktur sacara manual sateuacan nambihan dua BCl a (BCL) sareng spirilloxanthin (CRT) [numutkeun Rps anu relevan Kapadatan kompleks LH1 sareng eusi karotenoid anu dipikanyaho. Spésiés (17)]. Salin subunit LH1 lengkep, teras anggo "Alat Peta Docking" UCSF Chimera pikeun ngalampirkeun di daérah non-modél anu caket tina kapadetan LH1, teras saring dina Coot; balikan deui prosésna dugi ka sadaya subunit LH1 parantos dimodelkeun. Pikeun struktur RC-LH114-W, ku cara ngekstrak kapadetan anu teu dialokasikeun dina Coot, protéinna dibagi tina komponén non-protéin anu sésana dina peta USCF Chimera sareng alat Autobuild dianggo pikeun ngadegkeun modél awal, sareng subunit anu sésana (protéin-W) Pemodelan. Dina PHENIX (49). Tambahkeun runtuyan anu leungit kana modél anu dihasilkeun dina Coot (48), teras sacara manual nyaring sadaya subunit. Kapadetan anu teu dialokasikeun sésana cocog sareng kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB CDL = CDL, POPC = 6PL sareng POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) sareng molekul UQ10 (U10). Anggo optimasi PHENIX (49) sareng optimasi manual dina Coot (48) pikeun nyampurnakeun modél awal anu lengkep dugi ka statistik modél sareng kualitas visual tina pasna teu tiasa ditingkatkeun deui. Pamungkas, anggo LocScale (50) pikeun ngasah peta lokal, teras laksanakeun sababaraha siklus modél kapadetan anu teu dialokasikeun sareng optimasi otomatis sareng manual.
Péptida, kofaktor, sareng lipid sareng kuinon sanésna anu dipasang dina kapadetan masing-masing dipidangkeun dina Gambar 1 sareng 2. S18 dugi ka S23. Inpormasi statistik tina modél ahir dipidangkeun dina Tabel S1.
Kajaba lamun disebutkeun béda, spéktra panyerepan UV/Vis/NIR dikumpulkeun dina spektrofotométer Cary60 (Agilent, AS) dina interval 1 nm ti 250 nm nepi ka 1000 nm sarta waktu integrasi 0,1 detik.
Éncérkeun sampel dina kuvet kuarsa kalayan jalur 2 mm ka A880 1, teras kumpulkeun spéktrum serapan antara 400 sareng 1000 nm. Spéktrum dikroik sirkular dikumpulkeun dina spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) dina interval 1 nm antara 400 nm sareng 950 nm dina laju scan 20 nm min-1.
Koéfisién punah molar ditangtukeun ku cara ngéncérkeun kompléks inti ka A880 sakitar 50. Éncérkeun volume 10μl dina 990μl buffer pangiket atanapi metanol, teras kumpulkeun spéktrum panyerepan langsung pikeun ngaminimalkeun degradasi BChl. Eusi BChl tina unggal sampel metanol diitung ku koéfisién punah dina 771 nm tina 54,8 mM-1 cm-1, sareng koéfisién punah ditangtukeun (51). Bagi konsentrasi BChl anu diukur ku 32 (RC-LH114-W) atanapi 36 (RC-LH116) pikeun nangtukeun konsentrasi kompléks inti, anu teras dianggo pikeun nangtukeun spéktrum panyerepan tina sampel anu sami anu dikumpulkeun dina koéfisién punah buffer. Tilu pangukuran anu diulang dicandak pikeun unggal sampel, sareng absorbansi rata-rata maksimum BChl Qy dianggo pikeun itungan. Koéfisién pamusnahan RC-LH114-W anu diukur dina 878 nm nyaéta 3280±140 mM-1 cm-1, sedengkeun koéfisién pamusnahan RC-LH116 anu diukur dina 880 nm nyaéta 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 diukur dumasar kana metode dina (52). Singkatna, HPLC fase tibalik (RP-HPLC) dilakukeun nganggo sistem Agilent 1200 HPLC. Larutkeun sakitar 0,02 nmol RC-LH116 atanapi RC-LH114-W dina 50μl metanol:kloroform 50:50 anu ngandung 0,02% (w/v) ferik klorida, teras suntikkeun Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm anu tos diseimbangan sateuacanna Larutkeun dina 1 ml-1 min-1 dina suhu 40°C dina pangleyur HPLC (80:20 metanol:2-propanol) dina kolom ×25 cm. Laksanakeun élusi isokratik dina pangleyur HPLC pikeun ngawas absorbansi dina 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) sareng 780 nm (BChl) salami 1 jam. Puncak dina kromatogram 275 nm dina 25,5 menit diintegrasikeun, anu henteu ngandung sanyawa sanés anu tiasa dideteksi. Area anu diintegrasikeun dianggo pikeun ngitung jumlah molar UQ10 anu diekstrak kalayan rujukan kana kurva kalibrasi anu diitung tina injeksi standar murni ti 0 dugi ka 5,8 nmol (Gambar S14). Unggal sampel dianalisis dina tilu ulangan, sareng kasalahan anu dilaporkeun pakait sareng SD rata-rata.
Hiji larutan anu ngandung kompleks RC-LH1 kalayan panyerepan Qy maksimum 0,1 disiapkeun nganggo 30 μM sitokrom c2 jantung kuda anu diréduksi (Merck, Inggris) sareng 0 dugi ka 50 μMUQ2 (Merck, Inggris). Tilu sampel 1-ml disiapkeun dina unggal konsentrasi UQ2 sareng diinkubasi sapeuting dina poék dina suhu 4°C pikeun mastikeun adaptasi lengkep kana poék sateuacan pangukuran. Larutan éta dimuat kana spektrofotometer modular OLIS RSM1000 anu dilengkepan ku kisi-kisi seuneu/garis 500 300 nm, inlet 1,24 mm, celah tengah 0,12 mm sareng celah outlet 0,6 mm. Saringan pass panjang 600 nm disimpen di lawang phototube sampel sareng tabung photomultiplier rujukan pikeun ngaluarkeun cahaya eksitasi. Absorbansi dipantau dina 550 nm kalayan waktos integrasi 0,15 detik. Cahaya eksitasi dipancarkeun tina LED M880F2 880 nm (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Inggris) ngaliwatan kabel serat optik dina inténsitas 90% ngaliwatan kontroler DC2200 (Thorlabs Ltd., Inggris) sareng dipancarkeun ka sumber cahaya dina sudut 90°. Sinar pangukur dibalikkeun kana eunteung pikeun mulangkeun cahaya naon waé anu mimitina henteu diserep ku sampel. Pantau absorbansi 10 detik sateuacan katerangan 50 detik. Teras absorbansi salajengna dipantau salami 60 detik dina poék pikeun meunteun tingkat dimana quinolol sacara spontan ngirangan sitokrom c23+ (tingali Gambar S8 pikeun data atah).
Data diolah ku cara nyocogkeun laju awal linier dina 0,5 dugi ka 10 detik (gumantung kana konsentrasi UQ2) sareng ngarata-ratakeun laju sadaya tilu sampel dina unggal konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 anu diitung ku koefisien pamusnahan masing-masing dianggo pikeun ngarobih laju kana efisiensi katalitik, diplot dina Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), sareng dipasangkeun kana modél Michaelis-Menten pikeun nangtukeun nilai Km sareng Kcat anu katingali.
Pikeun pangukuran panyerepan samentawis, sampel RC-LH1 diéncérkeun jadi ~2μM dina buffer IMAC anu ngandung 50 mM natrium askorbat (Merck, AS) sareng 0,4 mM Terbutin (Merck, AS). Asam askorbat dianggo salaku donor éléktron kurban, sareng tert-butaclofen dianggo salaku inhibitor QB pikeun mastikeun yén donor RC utama tetep diréduksi (nyaéta, henteu difotooksidasi) sapanjang prosés pangukuran. Kira-kira 3 ml sampel ditambahkeun kana sél anu muter khusus (diaméterna sakitar 0,1 m, 350 RPM) kalayan panjang jalur optik 2 mm pikeun mastikeun yén sampel dina jalur laser gaduh waktos anu cekap pikeun adaptasi poék antara pulsa éksitasi. Anggo pulsa laser ~100-fs pikeun ngagedékeun sistem laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, AS) pikeun ngarangsang sampel dina 880 nm dina laju pangulangan 1 kHz (20 nJ pikeun NIR atanapi 100 nJ pikeun Vis). Sateuacan ngumpulkeun data, pasihan sampel kana cahaya éksitasi salami sakitar 30 menit. Paparan bakal nyababkeun inaktivasi QA (kamungkinan ngirangan QA sakali atanapi dua kali). Tapi perhatoskeun yén prosés ieu tiasa dibalikkeun deui sabab saatos adaptasi poék anu lami, RC laun-laun bakal uih deui kana aktivitas QA. Spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) dianggo pikeun ngukur spéktrométer transien kalayan waktos reureuh -10 dugi ka 7000 ps. Anggo parangkat lunak Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) pikeun misahkeun sét data, teras gabungkeun sareng standarisasi. Anggo pakét parangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) pikeun nganggo sét data gabungan pikeun kéngingkeun spéktra diferensial anu aya hubunganana sareng buruk, atanapi anggo fungsi anu ngahijikeun sababaraha eksponen sareng réspon instrumen pikeun nyocogkeun évolusi spéktral panjang gelombang tunggal dina Origin (OriginLab, USA).
Sakumaha anu parantos disebatkeun di luhur (53), pilem fotosintétik anu ngandung kompleks LH1 anu kakurangan anteneu RC sareng periferal LH2 parantos disiapkeun. Mémbran diéncérkeun dina 20 mM tris (pH 8.0) teras dimuat kana kuvet kuarsa kalayan jalur optik 2 mm. Pulsa laser 30nJ dianggo pikeun ngarangsang sampel dina 540 nm kalayan waktos reureuh -10 dugi ka 7000 ps. Olah set data sapertos anu dijelaskeun pikeun Rps. sampel pal.
Mémbran ieu di-pélét ku cara séntrifugasi dina 150.000 RCF salami 2 jam dina suhu 4°C, teras absorbansina dina 880 nm disuspensikeun deui dina 20 mM tris-HCl (pH 8.0) sareng 200 mM NaCl. Larutkeun mémbran ku cara diaduk lalaunan dina 2% (w/v) β-DDM salami 1 jam dina tempat anu poék dina suhu 4°C. Sampel ieu diéncérkeun dina 100 mM trietilamonium karbonat (pH 8.0) (TEAB; Merck, Inggris) kana konsentrasi protéin 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pamrosésan salajengna dilaksanakeun tina metode anu parantos diterbitkeun sateuacanna (54), dimimitian ku pangéncéran 50 μg protéin kana total 50 μl TEAB anu ngandung 1% (w/v) natrium laurat (Merck, Inggris). Saatos sonikasi salami 60 detik, éta diréduksi ku 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, Inggris) dina suhu 37°C salami 30 menit. Pikeun S-alkilasi, inkubasi sampel ku 10 mM metil S-metiltiometanasulfonat (Merck, Inggris) teras tambahkeun tina larutan stok isopropanol 200 mM salami 10 menit dina suhu kamar. Pencernaan protéolitik dilaksanakeun ku cara nambihan 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega Inggris) teras diinkubasi dina suhu 37°C salami 3 jam. Surfaktan laurat diekstrak ku cara nambihan 50 μl etil asetat sareng 10 μl 10% (v/v) asam trifluoroasetat kelas LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Inggris) sareng divorteks salami 60 detik. Pamisahan fase dipromosikeun ku cara sentrifugasi dina 15.700 RCF salami 5 menit. Numutkeun protokol produsén, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) dianggo pikeun sacara saksama nyedot sareng ngadésaluran fase handap anu ngandung péptida. Saatos dikeringkeun ku sentrifugasi vakum, sampel dilarutkeun dina 0,5% TFA sareng 3% asetonitril, sareng 500 ng dianalisis ku kromatografi nanoflow RP digabungkeun sareng spéktrométri massa nganggo parameter sistem anu dijelaskeun sateuacanna.
Anggo MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pikeun idéntifikasi sareng kuantifikasi protéin pikeun milarian database proteome Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomik spéktrometri massa parantos disimpen dina ProteomeXchange Alliance ngalangkungan repositori mitra PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) dina idéntifikasi sét data PXD020402.
Pikeun analisis ku RPLC digabungkeun sareng spéktrométri massa ionisasi éléktrospray, kompleks RC-LH1 disiapkeun tina Rps tipe liar. Ngagunakeun metode anu diterbitkeun sateuacanna (16), konsentrasi protéin anu dihasilkeun dina sél palustris nyaéta 2 mg ml-1 dina 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl sareng 0,03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad)) DDM. Numutkeun protokol produsén, anggo kit purifikasi 2D (GE Healthcare, USA) pikeun ngekstrak 10 μg protéin ku metode présipitasi, sareng ngaleyurkeun endapan dina 20 μl 60% (v/v) asam format (FA), 20% (v/v) Asetonitril sareng 20% ​​(v/v) cai. Lima mikroliter dianalisis ku RPLC (Dionex RSLC) digabungkeun sareng spéktrométri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Anggo kolom MabPac 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) pikeun misahkeun dina suhu 60 °C sareng 100 μl mnt -1, kalayan gradien 85% (v / v) pangleyur A [0,1% (v / v) FA sareng 0,02% (V/v) larutan cai TFA] kana 85% (v/v) pangleyur B [0,1% (v/v) FA sareng 0,02% (v/v) dina 90% (v/v) asetonitril TFA] Nganggo sumber ionisasi éléktrospray standar sareng parameter standar salami langkung ti 60 menit, spéktrométer massa kéngingkeun 100 dugi ka 2750 m/z (rasio massa-ka-muatan). Kalayan bantosan portal sumber daya bioinformatika ExPASy alat FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), petakeun spéktrum massa kana subunit kompleks.
Sél-sélna dipelak salami 72 jam dina 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), sedeng (30μMm-2 s-1) atanapi luhur (300μMm-2 s-1) cahaya. Médium M22 (médium M22 dimana amonium sulfat dileungitkeun sareng natrium suksinat diganti ku natrium asetat) dina botol 100 ml anu luhurna disekrup (23). Dina lima siklus 30 detik, manik-manik kaca 0,1 mikron dihias dina babandingan volume 1:1 pikeun ngalisis sél sareng didinginkan dina és salami 5 menit. Zat anu teu leyur, sél anu teu pegat, sareng manik-manik kaca dipiceun ku cara séntrifugasi dina 16.000 RCF salami 10 menit dina mikrosentrifugasi méja. Mémbran dipisahkeun dina rotor Ti 70.1 kalayan 100.000 RCF dina 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kalayan gradien sukrosa 40/15% (w/w) salami 10 jam.
Sakumaha anu dijelaskeun dina karya kami sateuacanna, imunodeteksi tag His dina PufW (16). Singkatna, kompleks inti anu dimurnikeun (11,8 nM) atanapi mémbran anu ngandung konsentrasi RC anu sami (ditangtukeun ku oksidasi ngirangan spéktrum bédana anu dikirangan sareng cocogkeun beban dina gél anu diwarnaan) dina 2x SDS loading buffer (Merck, Inggris) diéncérkeun dua kali. Protéin dipisahkeun dina réplika gél NuPage 12% bis-tris (Thermo Fisher Scientific, Inggris). Gél diwarnaan ku Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Inggris) pikeun ngamuat sareng ngavisualisasikeun subunit RC-L. Protéin dina gél kadua dipindahkeun ka mémbran polivinilidena fluorida (PVDF) anu diaktipkeun metanol (Thermo Fisher Scientific, Inggris) pikeun immunoassay. Mémbran PVDF diblokir dina 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 sareng susu bubuk skim 5% (w/v), teras diinkubasi sareng antibodi primér anti-His (dina Éncérkeun buffer antibodi [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl sareng 0.05% (v/v) Tween-20] dina 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) salami 4 jam. Saatos dikumbah 3 kali salami 5 menit dina buffer antibodi, mémbran digabungkeun sareng antibodi sekundér anti-tikus peroksidase horseradish (Sigma-Aldrich, Inggris) (diéncérkeun 1:10.000 dina buffer antibodi) Inkubasi pikeun ngamungkinkeun deteksi (5 menit saatos 3 kali dikumbah dina buffer antibodi) nganggo substrat kemiluminesensi WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) sareng Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Inggris).
Ku cara ngagambar distribusi inténsitas unggal gél anu diwarnaan atanapi jalur immunoassay, ngahijikeun daérah di handapeun puncak sareng ngitung babandingan inténsitas RC-L (gél anu diwarnaan) sareng Protein-W (immunoassay), dina ImageJ (57) Prosés gambar. Babandingan ieu dirobih janten babandingan molar ku cara nganggap yén babandingan RC-L ka protéin-W dina sampel RC-LH114-W murni nyaéta 1:1 sareng normalisasi sadaya set data sasuai.
Kanggo bahan tambahan pikeun tulisan ieu, mangga tingali http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ieu mangrupikeun artikel aksés kabuka anu disebarkeun dina syarat-syarat Lisénsi Atribusi Creative Commons. Artikel ieu ngawenangkeun panggunaan, distribusi, sareng réproduksi anu teu diwatesan dina média naon waé kalayan syarat yén karya aslina disitasi kalayan leres.
Catetan: Kami ngan ukur nyuhunkeun anjeun pikeun masihan alamat email anjeun supados jalmi anu anjeun rekomendasikeun ka halaman éta terang yén anjeun hoyong aranjeunna ningali email éta sareng éta sanés spam. Kami moal ngarékam alamat email naon waé.
Patarosan ieu dianggo pikeun nguji naha anjeun pangunjung sareng nyegah kiriman spam otomatis.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur résolusi luhur tina kompléks bubu cahaya 1 di puseur réaksi méré wawasan anyar kana dinamika kuinon.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur résolusi luhur tina kompléks bubu cahaya 1 di puseur réaksi méré wawasan anyar kana dinamika kuinon.
© 2021 Asosiasi Amérika pikeun Kamajuan Élmu. sadaya hak disimpen. AAAS mangrupikeun mitra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef sareng COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.